Sector agroalimentario

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Práctica 7 Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa
Objetivo: que el estudiante conozca un método de análisis de ácidos nucleicos

Fundamento
Como se mencionó en la Práctica 3 “Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida”, la electroforesis es el movimiento de partículas cargadas en un campo eléctrico. A diferencia de las proteínas, las cuales pueden tener una cargapositiva o negativa, los ácidos nucleicos están cargados de forma negativa debido a su esqueleto de grupos fosfato. Por lo tanto, en una electroforesis, los ácidos nucleicos migrarán hacia el polo positivo, es decir, el ánodo. Además de la poliacrilamida, la agarosa puede se utilizada como soporte para la corrida electroforética. La agarosa es un polisacárido extraído de algas marinas que tiene lapropiedad de mantenerse en estado sólido a temperatura ambiente pero que a altas temperaturas se torna líquida. Esta característica permite una fácil preparación de una matriz porosa para ser usada en electroforesis: simplemente se pesa la cantidad de agarosa requerida, se disuelve en un amortiguador adecuado, se calienta y se “chorrea” sobre un molde particular. Una ventaja que posee la agarosasobre la acrilamida es que no es un compuesto tóxico y además permite el análisis de ácidos nucleicos con pesos moleculares muy variados. Sin embargo, su poder de resolución es menor que el de los geles de poliacrilamida. La concentración de agarosa típicamente utilizada para electroforesis está entre el 0.5 % y el 2%. La concentración a usar se escoge según el tamaño del ácido nucleico a analizar.Esto porque la concentración de agarosa define el tamaño de los poros de la matriz, a mayor concentración, menor el tamaño de los poros y viceversa. Durante la electroforesis, los ácidos nucleicos lineales con un alto peso molecular migrarán al ánodo más lentamente que ácidos nucleicos lineales con un menor peso molecular. La razón de esto es que los ácidos nucleicos de alto peso tardan mástiempo en atravesar los poros de agarosa. En el caso de ácidos nucleicos no linealizados, como plásmidos circulares en conformación nativa, la migración no solo dependerá del peso molecular sino también de otros aspectos como el grado de superenrrollamiento que éste poseea. Generalmente en una preparación de plásmido se pueden observar distintas conformaciones de la misma molécula, la formasuperenrrollada, la forma semi relajada y una relajada. Dependiendo de las condiciones externas como pH y salinidad se pueden observar todas las formas o solo una (s). Una electroforesis típica consiste de los siguientes pasos:

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1. Preparar un gel de agarosa a la concentración requerida 2. Mezclar las muestras a analizar con un amortiguador adecuado y un colorante (azul de bromofenol) el cual indicael frente de corrida de la electroforesis 3. Montar las muestras en el gel 4. Realizar la corrida electroforética 5. Visualizar los ácidos nucleicos. Para la visualización de los ácidos nucleicos se utiliza un colorante fluorescente, el bromuro de etidio. Este colorante tiene la propiedad de intercalarse entre las bases nitrogenadas del ADN y el ARN. Debido a esta propiedad es un agentemutagénico y debe manipularse con cuidado. El bromuro de etidio generalmente se incorpora a la agarosa antes de “chorrear” el gel, o puede incorporarse luego de la corrida electroforética. Algunos de los usos de la electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa son: determinar los tamaños moleculares de los ácidos nucleicos, analizar los fragmentos cortados con enzimas de restricción, comparar lostamaños entre sí de distintos tipos de ADN y aislamiento y recuperación de fragmentos de ADN purificados. En nuestro caso, lo utilizaremos para analizar la preparación de plásmido que se realizó durante la Práctica 7 “Aislamiento de ADN de plásmido”.

http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/virgel .html usted podrá realizar una corrida electroforética virtual de una muestra...
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