Secuencia De Adn

FACULTAD DE MEDICINA














ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA




CURSO : Biología


TEMA : Técnicas de Secuenciación de ADN

DOCENTE : Joe Ruiz Huapaya.



INTEGRANTES : Carranza Pacheco Jhon.



HUACHO – PERÚINTRODUCCION

El método de secuenciación utilizado aquí es el desarrollado por Sanger en 1975. Este consiste en la incorporación de didesixinucleótidos marcados fluorescentemente a una cadena de ADN durante el proceso de copiado de la misma. Los didesixinucleótidos no poseen un grupo 3´-OH necesario para la formación del enlace fosfodiester que permite la uniónentre nucleótidos, por lo tanto se interrumpe la elongación de la cadena cada vez que uno de estos es incorporado en ella. De este modo se generan secuencias de diferentes tamaños. Estas se hacen migran a través de un gel de poliacrilamida donde se separan por tamaños. El equipo de secuenciación cuenta con un dispositivo que permite captar la emisión de luz de los cuatro didesixinucleótidos. Lalectura se hace entonces partiendo de las secuencias más cortas hasta la secuencia completa, y se genera un gráfico con picos de emisión de luz en la posición de cada uno de los nucleótidos de la secuencia de interés (cromatograma).
Primer paso se prepara la secuencia de interés o templado de la reacción de secuencia. Esto consiste en la amplificación de la misma vía PCR. Una vez culminado el PCRla secuencia debe ser limpiada para eliminar los restos de primer y posibles inhibidores de la reacción de secuencia. Es recomendable mirar el producto de PCR antes de la limpieza y hacerlo migrar unos tres dedos en un gel de agarosa, para estar seguros de que la secuencia no presenta dobles bandas ni barridos. Si este es el caso, es necesario aislar la banda de interés del gel y limpiarla.
Elsegundo paso es la cuantificación del producto de PCR limpio. La reacción de secuencia es muy sensible a la concentración del ADN templado, grandes cantidades inhiben la reacción (los reactivos se consumen rápidamente, como resultado se obtienen secuencias truncadas) y las pequeñas cantidades generan intensidades de luz pequeñas que pueden ser confundidas con el ruido de fondo. Adicionalmente setiene establecida la cantidad de ADN templado para varios tipos y tamaños de secuencias.
El tercer paso es la reacción de secuencia. Esta consiste en el copiado de la secuencia patrón, no es una amplificación de la secuencia como en el caso de la PCR, de allí que la concentración del ADN inicial sea tan restrictiva. La reacción de secuencia necesita de la hebra molde, uno solo de los primeros (lainclusión de los dos primeros genera dos secuencias superpuestas ilegibles), una enzima polimerasa de ADN, el cofactor de la enzima MgCl2, una solución tampón (buffer), los cuatro desoxinucleotidos (dNTPs) y los cuatro didesoxinucleotidos marcados (ddNTPs). Generalmente los kit de secuenciación traen una solución con la mezcla adecuada de dNTPs, ddNTPs, la enzima y el MgCl2. En nuestro caso,utilizamos el kit Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems) y la mezcla de reactivos de denomina Terminator Ready Reaction mix o Big Dye. La reacción de secuencia se lleva a cabo en un termociclador donde se repite un programa de extensión que consta de, un paso de desnatulalización de la secuencia de ADN a 96°C, uno para el anhealing de la secuencia a una temperatura de 50°C y el dela extensión de la secuencia a 60°C.
El cuarto paso es la precipitación de la reacción de secuencia. En este se eliminan los reactivos sobrantes de la reacción y otras moléculas que puedan interferir en la lectura del secuenciador. Existen varios métodos de precipitación de la secuencia, aquí se muestran dos de ello uno basado en etanol e isopropanol y otro donde se utilizan perlitas magnéticas...