Secuenciación masiva de dna

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TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN MASIVA DE DNA

La secuenciación del ADN ha revolucionado la biomedicina, y el progreso ha sido implacable desde que se inventó hace más de 30 años. La secuencia completa de ADN del genoma humano fué la culminación de una década de trabajo por un gran número de científicos. Menos de diez años más tarde, los instrumentos llamados "de nueva generación“ hacen que hoy seaposible que un solo laboratorio produzca la misma cantidad de datos en una semana.

SECUENCIADORES DE PRIMERA GENERACIÓN

El método de Maxam y Gilbert permitía secuenciar el ADN original y detectar modificaciones en el mismo, pero fue el método de Sanger el que terminó siendo más popular (Método de terminación de la cadena). En sus orígenes se trataba de un método manual, muy tedioso ypeligroso (compuestos radioactivos) y con una capacidad de lectura de unas 80 pb. A finales de los 90 esta metodología se adaptó a estrategias menos nocivas por la utilización de dideoxinucleótidos marcados con fluorescencia que se analizaban en una electroforesis capilar y producían un cromatograma a partir del cual se deducía la secuencia en el ordenador. Esto permitió mejorar, automatizar y aumentarel redimiento del proceso de secuenciación. Esto llevó al desarrollo de secuenciadores tipo ABI Prism (Applied Biosystems) o CEQ-serie (Beckman Coulter). Esta tecnología permitía secuenciar a la vez 96 muestras de ADN en unas pocas horas, y la longitud de las secuencias que producía estaba entre 500 y 1000 bases. Motivados por estos avances, en 1990 se firmó el “Proyecto Genoma Humano”. En 1995se publicó el primer genoma secuenciado de un organismo de vida libre, Haemophilus influenzae. En el año 2001 se publicó el primer borrador del genoma humano que costó casi 3.000 millones de dólares para leer 3.000 millones de nucleótidos. Esto estimuló a los científicos a buscar soluciones más baratas.

SECUENCIADORES DE SEGUNDA GENERACIÓN

La búsqueda de abaratar costes condujo a desarrollarestos secuenciadores llamados de segunda generación, capaces de generar cientos de miles de secuencias en paralelo, secuenciadores de alto rendimiento (high-throughput ), gracias a la inmovilización de las reacciones en una superficie sólida. Se pueden considerar “nanoreacciones” ya que utiliza mínima cantidad de reactivos y esto además abarata el coste por base leída. La reacción está basada enla pirosecuenciación del ADN, una técnica no fluorescente que mide la liberación de pirofosfato en una reacción de polimerización mediante una serie de reacciones enzimáticas acopladas que liberan luz cada vez que se incorpora un nucleótido. Produce una imagen que se analiza para proporcionar un flujograma, que una vez interpretado por el ordenador, devuelve la secuencia de nucleótidos. Estatecnología fue desarrollada por la empresa 454 Life Sciences que fue absorbida por Roche. El primer modelo comercial, el GS20, era capaz de secuenciar hasta 20 millones de bases en 4 hs. En el año 2007 apareció el modelo GS-FLX, mejorando la reacción química de secuenciación era capaz de producir hasta 100 millones de bases en el mismo tiempo. En 2009 el GS-FLX-Titanium que genera secuencias de 400bases. La longitud de las lecturas generadas se acerca a las obtenidas por el método de Sanger, por lo que son ideales para la secuenciación de genomas de novo, pero tienen el inconveniente que se confunde en las secuencias homopoliméricas. Los secuenciadores 454GS en todas sus versiones son usados exclusivamente por laboratorios de investigación.

Al mismo tiempo la compañía Solexa desarrolla otrotipo de tecnología para la secuenciación de ADN. Es un método basado en la polimerización del ADN, donde la incorporación de un nucleótido marcado con fluorescencia y protegido en la cadena naciente impide que ésta siga creciendo. Tras detectar la señal fluorescente, se elimina el grupo protector y se puede incorporar otro nucleótido marcado, con lo que empieza de nuevo el ciclo.
Otra compañía,...
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