Separacion de pigmentos utilizando disolventes organicos

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PRÁCTICAS DE FISIOLOGÍA VEGETAL EXTRACCIÓN DE PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS MEDIANTE DISOLVENTES QUÍMICOS 1. INTRODUCCIÓN En las plantas superiores, la fotosíntesis es posible debido a la presencia en el cloroplasto, concretamente en las membranas tilacoidales, de una serie de pigmentos que tienen capacidad para captar la luz. Existen dos tipos básicos de pigmentos fotosintéticos: Clorofilas.Compuestas por una porfirina que lleva incorporado un átomo de magnesio en el centro del núcleo tetrapirrólico . El ión Mg2* está coordinado con los cuatro átomos de nitrógeno centrales, lo que hace de la clorofila un complejo extraordinariamente estable. La "cabeza" que acabamos de describir, está unida a una "cola", el fitol, que es un alcohol de 20 átomos de carbono. Cabeza y cola se unen a través deun enlace éster en el que intervienen el grupo alcohólico del fitol y el grupo carboxilo de un ácido propiónico que está unido al anillo IV del núcleo tetrapirrólico. Existen varios tipos de clorofilas, las más importantes de las cuales son la "a", y la "b". La clorofila a tiene un grupo -CH3 en el anillo II mientras que la clorofila b tiene un grupo -CHO en esa misma posición. Carotenoides. Actúancomo pigmentos accesorios en el proceso de la fotosíntesis. Existen dos tipos de pigmentos carotenoides: carotenos y xantofilas. Los carotenos son hidrocarburos isoprenoides que no contienen oxígeno y están formados por largas moléculas con un sistema de enlaces conjugados alternantes, dobles y sencillos, rematados en cada extremo por un anillo de ciclohexano insaturado- tienen coloramarillo-anaranjado. Las xantofilas tienen una estructura muy similar a la de los carotenos y su diferencia estriba en la incorporación de oxígeno en los extremos de la molécula. Según el grupo que se incorpore existen variedades dentro de las xantofilas. Son de color amarillo. 2. OBJETIVO Separar clorofilas a y b, carotenos y xantofilas basándose en sus diferencias de solubilidad, que a su vez, son unaconsecuencia de sus diferencias estructurales. 3.MATERIAL Hojas frescas o secas de espinaca o de acelga 2 pipetas de 20 y 5 ml Embudo, papel de filtro y centrífuga Imágenes tomadas de Buchanan, Gruissen & Jones. Biochemistry & Molecular Biology of Plants. American Society of Plant Biologists. Rockville, Maryland. USA. 2000

1

Granatario Mortero y mano Probeta graduado de 100 ml Ampolla dedecantación de 250 ml 2 Erlenmeyer de 125 ml Gradilla y dos tubos de ensayo gruesos Acetona Éter de petróleo de entre 60 y 80 º Metanol acuoso del 92% v/v (atención es tóxico por inhalación y en contacto con la piel) Éter etílico Solución de KOH al 30% p/v en metanol Carbonato cálcico

4. METODOLOGÍA A 5 g de hojas frescas1 desnerviadas y troceadas, se les añaden 25 ml de acetona al 100%(preferiblemente con una pizca de carbonato cálcico para neutralizar los tejidos ácidos y prevenir una pérdida parcial de magnesio de las clorofilas) y se machaca la mezcla en el mortero. Una vez obtenido el extracto, se filtra a través de papel o bien se centrifuga durante 3 minutos a 7000 rpm con objeto de eliminar los restos celulares. La solución resultante contiene clorofilas a y b, carotenoides ymoléculas incoloras solubles en acetona. El siguiente paso consiste en cambiar el disolvente, la acetona, por éter de petróleo. Para ello, se toman 30 ml de éter de petróleo y se llevan a una ampolla de decantación ¡asegúrate de que está cerrada la salida!. Se añaden 20 ml del extracto. A continuación, y con objeto de eliminar la acetona, se añaden 35 ml de agua destilada a la mezcla, lentamente ydejándola resbalar por las paredes. Se agita suavemente y se espera hasta que se separen dos capas, en la superior estarán los pigmentos que se pretenden separan y en la inferior la mezcla de acetona y agua. Se abre la llave de la ampolla, se recoge esta última capa y se tira. Se repite el lavado con agua dos veces más, y en la última, y para asegurarse que se haya eliminado toda la acetona, se deja...
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