Separacón de proteinas por electroforesis en gel de poliacrilamida

OBJETIVOS
Efectuara la separación de proteínas de varias muestras mediante la técnica de electroforesis en gel de poliacrilamida.
Determinara cual es el tamaño “óptimo” de poro del gel, para la mejor separación de cada una de las muestras.
DATOS EXPERIMENTALES E INFORME
Tabla 1. Características de los electroferogramas a diferentes % T
%T 5.5 7.5 10 12.5
Característica
Longitud delgel antes de teñir, cm (l) 7.2 6.5 6.8 7.2
Longitud del gel después de teñir, cm (l’) 8.4 7.0 7.3 8.3
Distancia recorrida por el colorante, cm, (f) 5.7 5.5 5.8 6.3

Tabla 2. Movilidad electroforética relativa promedio.
%T Proteína Valores de m (cm) Distancia promedio recorrida m (cm) M Log
(M X 100) Nº de bandas

5.5 Suero 5.8 6.2 6.1 6.03 0.907 1.957 11
Yogurt 6.5 6.7 - 6.6 0.992 1.99612
Clara 6.7 6.8 - 6.40 0.962 1.983 10
Leche 4.5 4.2 - 4.35 0.654 1.815 6

7.5 Suero 6.3 6.5 - 6.4 1.079 2.033 9
Yogurt 6.1 6.5 - 6.3 1.062 2.026 10
Clara 6.3 6.1 - 6.2 1.046 2.019 12
Leche 4.6 4.0 - 4.3 0.725 1.86 6

10.0 Suero 3.7 3.6 - 3.65 0.58 1.76 16
Yogurt 4.8 4.8 - 4.8 0.77 1.89 14
Clara 5.1 5.1 - 5.1 0.68 1.83 15
Leche 3.1 3.0 - 3.05 0.36 1.56 7

12.5 Suero 4.0 4.0 -4.0 0.550 1.740 12
Yogurt 5.1 5.1 - 5.1 0.702 1.846 11
Clara 5.2 5.2 - 5.2 0.716 1.855 13
Leche 4.2 4.2 - 4.2 0.578 1.762 8

Ejemplo del calculo de m, M y Log (M X 100) para la proteína elegida de suero(seroalbumina) con tamaño de poro de 10.0

Valores de m 3.7 y 3.6
Promedio de m= 3.65
Longitud del gel antes de teñir en cm (l)= 6.8
Longitud del gel después de teñir en cm(l’)= 7.3
Distancia recorrida por el colorantes en cm (f)= 5.8

M=(l/(l' ))(m/f)
M=((6.8)/(7.3))((3.65)/(5.8))=0.58
Log (M x 100)
Log (0.58 x 100)= 1.76

Figura2. Grafica de ferguson.
Se muestra la relación entre la cantidad de acrilamida y bisacrilamida con respecto al logaritmo de la movilidad electroforética relativa de la proteína elegida para cada muestra, en este caso seroalbuminapara el suero, ovoalbúmina para la clara y caseína para leche y yogurt.

Diga cual % T recomienda para la selección de las proteínas de cada muestra, ¿Por qué?
Suero= 10.0
Yogurt=10.0
Clara= 10.0
Leche= 12.5
Porque en cada caso fue el tamaño de poro en donde se observo el mayor numero de bandas de las proteínas de cada muestra.
Escriba la reacción completa para la copolimerizacion dela acrilamida y la bisacrilamida por radicales libres, ¿qué función tienen el TEMED y el persulfato de amonio?Unión de la acrilamida con la bis-acrilamida
Persulfato de amonio (agente oxidante) y TEMED como agente reductor. Actúan como agentes catalizadores, Persulfato de amonio (agente oxidante) y TEMED como agente reductor.
La polimerización se inicia con la formación de radicales libres delmonómero, que se producen por radicales libres de oxígeno, por causa de la acción de iones persulfato. Las aminas terciarias como el N, N, N, N´-tetrametilen-diamina (TEMED) se emplean como catalizadores de esta reacción, porque causan la formación de radicales libres del persulfato
Mencione una aplicación de la electroforesis preparativa y una de la electroforesis analítica.
Electroforesispreparativa
Características ácido-básicas de las proteínas presentes en un extracto crudo, lo que da la información necesaria si se pretende realizar una separación cromatográfica basada en diferencias de carga.
Electroforesis analítica
Determinar Nº de cadenas polipeptídicas de las proteínas.

Defina velocidad de migración y movilidad electroforética.
La velocidad con que el ión se dirigehacia el cátodo o el ánodo.
Comportamiento de una molécula bajo la acción de un campo eléctrico. En un sistema electroforético actúan dos fuerzas opuestas sobre cada molécula con carga eléctrica, la fuerza debida al campo eléctrico y la fuerza debida a la resistencia de la disolución; el resultado de ambas fuerzas es el movimiento del ion a través de la disolución a una velocidad constante,...