Simon

Páginas: 5 (1033 palabras) Publicado: 25 de junio de 2012
EXTRACCION DE PLASMIDOS DE DNA DE E.coli.

Método de lisis alcalina.




INTRODUCCION:

Disponer de la cantidad suficiente y pureza de DNA para su manipulación es una de las prioridades en biología molecular. El DNA genómico y plasmidico puede ser extraido de células procariotas y eucariotas por diferentes métodos, fenol-cloroformo, precipitación con alcohol,éter,polietilnglicol, etc. Uno de l mas utlizado es la lisis alcalina, y precipitación con isopropanol que permite la extracción y separación del DNA genómico de plasmidos recominantes de bacterias. La extracción de DNA con NaOH se basa en la lisis de la celula bacteriana con álcali y SDS en una solución amortiguadora de glucosa y neutralización con una sal de acido acético que permite la precipitaciónde restos celulares.

Este método permite obtener DNA de muy buena calidad para su caracterización y digestión con enzimas de restricción, asi como también ser utilizado para la transformación de vehículos apropiados de expresión. El método es universal, lo que incia que se puede utilizar para la extracción de cualquier plasmido de DNA de células de E.coli de entre 3,000 y 7000 pb. Los plasmidosobtenidos por este método generalmente presentan las formas circular-superenrrollada y circular-relajada, que se visualizan como 2 bandas de agarosa.



OBJETIVO:

Obtener plasmido recombinante de calidad aceptable para su manipulación génica, transformación y digestión con enzimas de restricción.

MATERIALES Y REACTIVOS.

1. Cultivo de 18hr de la cepa recombinante de E.coli.2. 1 tubo conixo esteril de 50 ml

3. Soluciones 1,2 y 3 para la extracción del plasmido;



Solución 1. Glucosa. 50 mM; Tris.Cl pH8, 25 mM; EDTA pH 8.0,

10 mM, Sln 1 se prepara en lotes de 100ml, se esteriliza por 15 min a 10 y se almacena a 4°C.

Solución 2. NAOH 0.2 Fresco, diluido de un stock 10N, SDS 1%.

Solución 3. Acetato de sodio 3 M pH 5.2

4. 1 caja de puntillasesteriles de 100-200µ

5. 20 tubos eppendorf de 1.5 ml esteriles

6. Micropipetas de 10µ, 200µ, 1000µ.

7. Horno o centrivap concentrador a 65°c

8. 1.0 de agua MQ esteril

9. Hielo frappe

10. RNAsa 10ml/ml



Redultados y discusión.

Muestra en el gel.

Carril. muestra . cantidad.

1 2.1 5µl

2 2.25µl

3 2.3 5µl

4 2.4 5µl





Analisis y evaluación



1. ¿En que se fundamenta la lisis alacalina para la extracción del DNA plasmidico?

En la extraccionde DNA con NaOH en la lisis de la celula con alcalinidad y SDS en una solución amortiguadora de glucosa y en su neutralización con una sal de acido acético que permite la presipitacion de restos celulares.

2. ¿Por qué elDNA genómico no se extrae con ese método?

Debido a su gran tamaño, aparte se sedimenta rápidamente debido a su desnaturalización rápida y no se puede renaturalizar adecuadamente.

3. ¿Por qué es necesario el fenol-cloroformo en la extracción de DNA plasmidico?

Este separa el DNA de proteínas y lípidos además de enzimas.

4. Además de etanol e isopropanol ¿Qué otro alcohol pudeursarse para precipitar el DNA plasmidico?

Alcohol isoamilico y polietilenglicol

5. Explica ¿Por qué se utiliza una lisis alcalina y no acida para la extracción del DNA plasmidico?

El acido rompe el dna plasmidico, es mas barato y es un método mas sencillo



6. ¿menciona un método comercial para la extracción de DNA plasmidico y en que se basa?


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