Staphylococcus aureus

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epidemiologia molecular :Electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) (Guía elaborada por MSc (c) Gertrudis Horna y MSc. Carmen Contreras)

La epidemiologia molecular se puede definir como una ciencia enfocada al estudio a nivel molecular, de la etiología, distribución y prevención de enfermedades genéticas, infecciosas y ambientales en las poblaciones humanas, de animales y de plantas y susposibles interacciones. Esta nueva rama de la ciencia ha surgido como consecuencia de la integración de la biología molecular a la investigación epidemiológica tradicional.
La aplicación de la biología molecular a la identificación de los subtipos microbianos y sus relaciones permite:
1) Identificar y confirmar brotes
2) Identificar la fuente de contaminación y las rutas de diseminación3) Evaluar si un aislamiento es parte del brote o si se relaciona con casos esporádicos
4) Confirmar la asociación con vehículo o vector
5) Determinar si una infección es nueva o recurrente
6) Realizar análisis de clonalidad: es decir, establecer relaciones genéticas entre dos o más microorganismos, comparando perfiles de ADN o “fingerprinting” de varios aislamientos a la vez. Esimportante establecer relaciones epidemiológicas entre los distintos aislamientos a la vez. Es importante relaciones epidemiológicas entre los distintos aislamientos considerando la relación témporo-espacial.

Métodos de Tipificación Bacteriana:


Los métodos clásicos de diagnostico bacteriológico se basan en la morfología de las colonias, en las técnicas de coloración y en el crecimientoy diferenciación en medios selectivos. Los métodos de tipificación pueden ser clasificados en fenotípicos y genotípicos según las características analizadas.

*Métodos Fenotípicos: incluyen la determinación de biotipos, perfil de resistencia a antibióticos, fagotipos, serotipos, electroforesis de enzimas (MLEE), proteínas de membrana externa (OMPs).

*Métodos genotípicos: detectan variacionesen la secuencia de ácidos nucleicos del microorganismo, analizan características mucho más estables que las fenotípicas y pueden ser mas discriminatorios ya que el genoma de cada cepa es único.


FUNDAMENTO DE LA TECNICA DE ELECTROFORESIS EN CAMPO PULSADO (PFGE):

El PFGE es una técnica que se basa en el polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción y para ello utiliza enzimasde restricción de corte poco frecuente que generan un número relativamente pequeño de fragmentos grandes de ADN. La técnica de PFGE que fue desarrollada por Schartz y Cantor en 1984 es una variante de la electroforesis en gel de agarosa, en la cual se cambia de manera periódica (por pulsos) la orientación del campo eléctrico. La duración del campo eléctrico alternado determina el rango deltamaño del ADN tan grandes como megabases. El ADN blanco sin cortar se obtiene de embeber el microorganismo intacto en moldes de agarosa y luego se lisa enzimáticamente la pared celular y se digieren las proteínas celulares. Posteriormente, el genoma asilado es digerido “in situ” con enzimas de restricción que tienen sitios de reconocimiento poco frecuente en el ADN en estudio. Después de la digestiónse corre en un gel de agarosa. Este gel es luego teñido con Bromuro de Etidio, se visualiza en un transluminador con luz UV y se efectúa el registro fotográfico para su posterior análisis.



ELECTROFORESIS EN GEL DE CAMPO PULSADO (PFGE)



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ESTUDIO PARA DETERMINAR LA RELACION CLONAL EN
Staphylococcus aureus

Reactivos

Low Melting Point Agarosa (o agarosaregular para preparar los plugs)
SeaKem GTG agarosa (gel para PFGE)
Caldo Lurea
Cell Suspensión Buffer (50Mm TRIS pH8; 50Mm EDTA pH8 )
Buffer TE (10mM Tris-HCl pH8 y 1mM EDTA, pH8)
Buffer TBE (151g Tris base, 51g Acido Bórico, 3.75g EDTA 0.5M )
Lambda Ladder PFG Marker (New England BioLabs)
Enzima Sma I (New England BioLabs)
Proteinasa K (10mg/mL, en TE)
10% Sodium Lauril Sarcosine...
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