Técnicas de secuenciación y su aplicación en las ciencias forenses

TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN Y SU APLICACIÓN EN LAS CIENCIAS FORENSES

Nidia Franco

Carné: 43253927

Maria Clara Maya

Carné: 32208104

Monografía presentada en el curso de Bioanálisis Forense al profeso Aníbal Gaviria

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

INSTITUTO DE BIOLOGÍA

Medellín

2005

TABLA DE CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN 3
2. MÉTODOQUÍMICO DE SECUENCIACIÓN 4
3. MÉTODO ENZIMÁTICO DE SECUENCIACIÓN 6
4. AUTOMATIZACIÓN DE LA SECUENCIA 7
4.1. SECUENCIADORES AUTOMATICOS 8
5. APLICACIÓN EN LAS CIENCIAS FORENSES 9
6. BIBLIOGRAFÍA 11
7. ANEXOS 11
7.1. MÉTODO QÚIMICO DE SECUENCACIACIÓN 11
7.2. MÉTODO ENZIMÁTICO DE SECUENCIACIÓN 12

INTRODUCCIÓN

La evolución genómica tuvo su apogeo en el año 2000 y está basada en losaportes de cuatro investigadores; Maxam y Gilbert, quienes desarrollaron en los años 70 el método químico se secuenciación de DNA; luego Frederick Sanger, quien en 1977 perfeccionó el método enzimático de secuenciación; y por último Leroy Hood, quien junto con sus colegas, Michael Hunkapiller y Lloyd Smith, en 1986, modificaron el método de Sanger

A finales de los años 70 se desarrollaron losmétodos que permitieron de manera simple y rápida, determinar la secuencia nucleotídica de cualquier fragmento de ADN. Estos primeros intentos de secuenciar ácidos nucleicos siguieron los pasos empleados en la secuenciación de proteínas: romper las moléculas en pequeños fragmentos, determinar su composición de bases y deducir la secuencia a partir de fragmentos solapantes. Este método resultarelativamente sencillo para proteínas donde estas resultan de la combinación de hasta 20 aminoácidos distintos, pero constituye un problema en el caso de los ácidos nucleicos donde la secuencia resulta de la combinación de únicamente cuatro nucleótidos diferentes

MÉTODO QUÍMICO DE SECUENCIACIÓN

Desarrollado por Maxam y Gilbert en 1977. Se basa en las propiedades químicas de las cuatrobases que componen el ADN que las hacen susceptibles a modificaciones específicas. Consiste de los siguientes pasos:

1. Fragmentación

Antes de comenzar se debe preparar el ADN genómico para que este pueda ser secuenciado. Esto consiste en fragmentar el ADN genómico, el método mas utilizado es mediante el corte enzimático utilizando enzimas de restricción, pero también puede emplearsecualquier otro método de fragmentación selectiva.

2. Marcaje del ADN.

Se puede realizar a partir de un ADN de cadena doble o sencilla, Este paso consiste en el marcaje de uno de los extremos de la cadena. Para marcar el extremo 5’ radiactivamente con 32ATP primero se debe quitar el fósforo presente en este extremo por medio de la hidrólisis utilizando la enzima fosfatasa alcalina y luego seadiciona el fosfato marcado transferido desde al ATP por medio de la enzima polinucleótido kinasa.

[pic]

El extremo 3’ también puede ser marcado radiactivamente. Actualmente se han desarrollado fluorocromos para marcar ambos extremos y así facilitar la detección del marcaje.

3. Modificación de las Bases y fragmentación del ADN

Esta es la etapa más importante y fundamental de todo elprocedimiento; en ella se busca generar fragmentos de ADN de cadena sencilla de tamaños variables, cuyo nucleótido final sea conocido. Así, el tamaño de la hebra final indicará el orden de la secuencia, de acuerdo con el último nucleótido.

La reacción debe ser llevada a cabo en cuatro tubos diferentes. En cada tubo se adicionan compuestos químicos que modifican las bases específicamente (Dimetilsulfato, Formato de piperidina, Hidracina y Hidracina + Alcali).

[pic]

El Dimetil Sulfato, metila el N7 de las Guaninas, debilitando el enlace entre los C8 y C9 para que sean susceptibles a la ruptura. El Formato de piperidina debilita el enlace glicosidico de las Adeninas y Guaninas protonando átomos de nitrógeno en los anillos de purina, lo cual conduce eventualmente a la depurinizacion. La...