Tecnica fish

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FISH

Técnica utilizada en la detección a traves de fluorescencia de secuencias específicas de DNA o RNA sobre cromosomas, células o tejidos, la cual se puuede utilizar en:

• Diagnóstico prenatal (de una morula se puede extraer una celula y sobre ella realizar hibridacion in situ, el resto de tejido se puede dejar en cultivo)
• Genómica
• Diagnóstico prenatal
•Biología de las neoplasias
• Mapeo génico
• Amplificación génica
• Investigación biomédica.

El FISH es una técnica altamente sensible. Puede detectar secuencias mayores a 800pb, mientras mas grande el segmento mas observamos al microscopio. Mientras mas grande la sonda, menor es la especificidad ya que aumentan las complementariedades inespecíficas.

Secuencias menores a700pb dificulta la observacion al microscopio de fuorescencia.
DNA: 700 – 800 PB
Sonda: 250 – 500 pb

A menor tamaño de la sonda mayor es la especificidad
A mayor tamaño de la sonda mayor sensibilidad

Si la sonda es muy grande le costara ingresar a la cromatina para hibridar con el DNA blanco.

5 pasos del FISH

1.- Identificacion del DNA blanco (lo que quiero estudiar)
2.-Identificacion de la sonda (comercial o preparada, complementaria al DNA blanco)
4.- Hibridación: se agrega la sonda denaturad al DNA cromosomico tambien denaturado y se deja hibridar a 37°C aprox (ROMPE PUENTES DE H DE SONDA Y DNA)
5.- Análisis: se elimina el exceso de sonda lavando con temperatura y formamida y se visualiza la hibridación en el microscopio.

Si tengo una hibridacion al 100% y algunasinespecificas, aumento un poco la temperatura y las uniones inespecificas al ser mas cortas se separan y la hibridacion completa se separa muy poco, al disminuir la temperatura se une otra vez en un 100% y asi tengo mi hibridación sonda- DNA.

La hibridacion se realiza entre 37 y 42°C, lo que dependera de la especificidad de la sonda, de la secuencia blanco, ya que si tengo muchas repeticiones AAT(20) no puedo aplicar temperaturas altas si se repite una vez, si se puede.

Elementos claves del FISH

*Temperatura: la utilizo para denaturar e hibridar
*Formamida: Permite la eliminacion de estructuras secundarias del DNA. Estabiliza y mantiene la separacion de las hebras simples de DNA e impide su renaturacion. Se utiliza en la denaturacion en concentraciones entre 50 y 90%, lo quedepende de la especificidad de la sonda y DNA blanco, permitira mayor o menor denaturacion.

*Concentracion de sales: Sodio por ejemplo, favorece renaturacion. SSC lleva cloruro de sodio y citrato de sodio. Al tener carga positiva une las 2 hebras negativas del DNA, actúa como un iman.

Balance permanente entre sales y formamida.

*concentracion de la sonda: si tengo una molecula e hibrida laseñal es muy debil, es mejor aumentar la cntidad de moleculas para que aumente la señal, muchas no por que pueden aumentar las uniones inespecificas.

*especificidad de la sonda: Aumenta con la adicion e DNA competidores como COT-1 (se une a sitios UTR, son tandem luego de un exón) y DNA esperma de salmon; los cuales se unen a las secuencias inespecificas donde se podria unir la sonda, loscompetidores al unirse 1° en esos sitios la sonda hibrida donde yo quiero hibridar.

Ventajas y desventajas

- Reducido tamaño de la secuencia que quiero detectar, por ejemplo un mRNA el cual esta solo de 10 a 20 copias por celula.
- Cromatina esté asociada a proteínas.
- Importancia en la fijacion, tipos de fijadores utilizados, deben ser coagulantes para que se generen mallas y la sondapueda ingresar. Proteínas a veces se adhieren a mi secuancia blanco y la enmascaran y sonda no encuentra su complementaria.
- Es fundamental aumentar la permeabilidad de la celula

•Permite obtener información topológica de secuencias genómicas blancos, por lo que se puede estudiar su localización y tamaño.
•¿Quépodemos identificar?:
–genomas de especies
–cromosomas completos...
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