tecnicas de aislamiento de proteinas




Índice
Introducción: 4
Selección de la fuente de proteína: 4
Aislamiento de una proteína. 4
Lisis celular: 5
Ruptura mecánica. 5
Homogeneización: 6
Mortero con arena o alúmina: 6
Prensa French: 6
Sonicación: 7
Congelación – descongelación: 7
Estabilización de las proteínas. 8
Determinación de las proteínas. 8
Estrategia general en la purificación de proteínas. 8
Solubilidadesde las proteínas 9
Efecto de las concentraciones salinas. 9
Efectos de los disolventes orgánicos. 9
Efectos del pH 9
Cristalización. 10
Procedimientos de separación basados en el tamaño molecular. 10
Diálisis: 10
Ultrafiltración: 11
Ultracentrifugación: 11
Centrifugación en gradiente de densidad: 12
Cromatografía de exclusión molecular. 13
Procedimientos de separación basados endiferencias de solubilidad 14
Precipitación isoeléctrica 14
Solubilización y precipitación por salado de las proteínas. 15
Fraccionamiento con disolventes 15
Efecto de la temperatura sobre la solubilidad de las proteínas. 16
Procedimientos de separación basados en la carga eléctrica. 16
Métodos electroforéticos: 16
Electroforesis de zona 17
Electroforesis de disco: 17
Enfoque isoeléctrico oelectroenfoque: 18
Electroforesis sobre papel: 18
Electroforesis en gel 18
Electroforesis en gel de la poliacrilamida (PAGE) 19
Electroforesis capilar (CE) 19
Cromatografía de intercambio iónico 19
Separación de proteínas por adsorción selectiva 21
Cromatografía sobre papel: 21
Cromatografía bidimensional sobre papel 22
Cromatografía de interacción hidrófoba 22
Cromatografía de afinidad concomplejo metal-quelato 22
Separaciones basadas en la especificidad de ligandos 22
Cromatografía de afinidad: 22
Técnicas inmunoquímicas: 23
Medición y análisis de proteínas 23
Espectrometría de masa 24
Método de Biuret 24
Método de Bradford 24
Método de BCA 25
Conclusión 25
Bibliografía 26







Introducción:
La purificación de proteínas es vital para la caracterización de lafunción, estructura en interacciones de la proteína de interés, por ejemplo una enzima un receptor celular o un anticuerpo. Las proteínas constituyen una fracción principal de la masa de todos los organismos. En los procesos biológicos las proteínas son el centro de acción. Prácticamente de todas las transformaciones moleculares que definen el metabolismo celular están medidas por catalizadoresproteicos. Las proteínas también desempeñan papeles regulatorios mediante el control de las condiciones extracelulares e intracelulares, y la transmisión de la información a otros componentes celulares. Además son componentes esenciales de la estructura de las células. Un de las claves para descifrar la función de una proteína dada es comprender su estructura. Las proteínas no tienen estructurasuniformes y regulares. Esto se debe, a que los 20 aminoácidos que las forman tienen propiedades químicas y físicas diferentes. (Voet, Fundamentos de Bioquímica. La vida a nivel molecular, 2009)1
Selección de la fuente de proteína:
La elección debe basarse en criterios tales como la facilidad de obtener cantidades suficientes del tejido que se aísla la proteína, la cantidad de proteína escogida enel tejido y cualquier propiedad peculiar de la proteína específica escogida que ayudaría en su estabilización y aislamiento. (Voet, Bioquìmica, 2004)2
La proteína debe aislarse en un estado relativamente puro antes de poder obtener información de la estructura o la función de una proteína particular. Como la mayor parte de las células contiene miles de proteínas diferentes, la purificación de unasola especie puede ser todo un desafío, en especial si la proteína se encuentra en baja concentración en la célula.
La purificación se mide como un incremento en la actividad específica, que es el índice entre la cantidad de esa proteína y el total de proteína presente en la muestra. (Karp, 2010)3
Aislamiento de una proteína.
La primera etapa en el aislamiento de una proteína, es la de...