TESIS COMPLETA 2013

UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA
FACULTAD DE MEDICINA
COMISIÓN DE ESTUDIOS DE POSTGRADO

MOLÉCULAS EXTRACELULARES DE BACTERIAS PATÓGENAS COMO
BLANCO PARA SU IDENTIFICACIÓN POR
RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR PROTÓNICA ( +HRMN).
Trabajo de Tesis Doctoral que se presenta para optar al título de Doctor en Ciencias de
la salud. Mención Patogenicidad Bacteriana.

Autor: Nina Polanco Daza
Tutor: OswaldoCarmona

Caracas, julio 2013

FELIX OSWALDO CARMONA
TUTOR

MIGUEL MARTIN LANDROVE
ASESOR

EDGARDO LEAL
ASESOR

RESUMEN

MOLÉCULAS EXTRACELULARES DE BACTERIAS PATÓGENAS
COMO BLANCO PARA SU IDENTIFICACIÓN POR
RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR PROTÓNICA ( +HRMN).
Autor: Nina Polanco Daza
Correo: n5polanc@hotmail.com
Tutor: Oswaldo Carmona.
Médico Microbiólogo
Correo: Oswaldocarmona45@gmail.com

Lasmoléculas extracelulares son importantes en la patogenia bacteriana porque
representan el primer contacto de la bacteria con la célula hospedadora, donde
producen desde alteraciones sutiles hasta la total toxicidad de la célula. Por tal razón,
se planteó el siguiente Objetivo: Evaluar las frecuencias de resonancia de moléculas
extracelulares en Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus yStreptococcus
agalactiae a través de espectroscopia por Resonancia Magnética Nuclear Protónica
(+HRMN). Métodos: Se aislaron de muestras clínicas, 10 cepas de cada una de las
especies en estudio. Posteriormente a su identificación fueron cultivadas en medio
líquido durante 18 a 24 horas a 37ºC. De estos cultivos se extraen 0,7 ml, se agregan a
la celda RMN, más 0,05 ml de D2O, para ser analizadas porespectroscopia +HRMN
(S+HRMN) en un espectrómetro BRUKER AM-300. Las muestras se corrieron con 128
barridos y el tiempo entre pulsos fue de un segundo. Los cultivos bacterianos fueron
centrifugados a 12.000 rpm durante 15 minutos a 4 ºC y filtrados a través de un filtro
millipore 0,22 µ. Las moléculas extracelulares y el paquete celular bacteriano
resuspendido en igual volumen con solución salina, fueronanalizadas por S +HRMN.
Los datos fueron procesados mediante el programa MatNMR V.3.90 y los espectros
analizados a través del programa SigmaPlot SPW 11.
Resultados: Los espectros de los cultivos bacterianos y de las moléculas extracelulares
presentaron señales características para cada grupo. Las principales señales que
contribuyeron a su identificación estuvieron ubicadas en la región alifáticadel espectro.
Conclusiones: A través de la espectroscopia +HRMN de las moléculas extracelulares de
Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus y Streptococcus agalactiae podría
facilitarse su detección temprana en el proceso infeccioso. Este es el primer reporte
de identificación bacteriana por moléculas extracelulares a través de +HRMN.
Palabras claves: Bacterias patógenas, moléculasextracelulares, espectroscopia,
Resonancia Magnética Nuclear protónica ( +HRMN).

ABSTRACT

Extracellular molecules are important in bacterial pathogenesis because through
them, the bacterium makes first contact with the host cell, where it plays a range
of biological functions ranging from subtle alterations, to overall cell toxicity.
Objective: To evaluate the resonance frequency of extracellularmolecules in
Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus and Streptococcus agalactiae
through Proton Nuclear magnetic resonance spectroscopy (+HNMR). Methods:
Bacteria were isolated from clinical samples, 10 strains of each species in the
study group. Subsequent to his identification were cultured in liquid medium for
18 to 24 hours at 37 ° C. These crops were extracted in 0.7 ml, and were added
to thecell NMR, plus 0.05 ml of D2O, to be analyzed by spectroscopy +HNMR
(S+HNMR) in a spectrometer BRUKER AM-300. The samples were run with 128
sweeps and the time between pulses was one second.
The bacterial cultures were centrifuged at 12,000 rpm for 15 minutes at 4 ° C.
Afterwards extracellular molecules and bacterial cell pellets were resuspended in
equal volumes with saline, and analyzed by...