TéCnicas MoléCulares De AnáLisis De Alimentos

TÉCNICAS MOLECULARES DE ANÁLISIS DE ALIMENTOS
11/07/2012 Ainhoa Sánchez Martín

TÉCNICAS MOLECULARES DE ANÁLISIS DE ALIMENTOS

ÍNDICE
Páginas
1. Los métodos inmunológicos ………………………………………………… A) Técnica ELISA ………………………………………………………………. · ·
Fases de un ensayo ELISA……………………………………….. Tipos de ensayos ELISA …………………………………………. 3-6 3-6 3-4 4-6

2. La clonación acelular: Reacción en cade lapolimerasa (PCR) ……….. · · *
Principio del método ……..……………………………………….. Etapas del proceso …….………………………………………….

6-12 6-7 7-10 11 11-12 13-14

SEPARACIÓN DE DNA POR ELECTROFORESIS ……………………. o ELECTROFORESIS EN GEL ……………………………………

3. Micromatrices de ADN ………………………………………………………...

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1. LOS MÉTODOS INMUNOLÓGICOS
Los métodos inmunológicospueden adoptar varios formatos, pero los más utilizados en el análisis de alimentos son los ensayos de tipo ELISA (por la sigla en inglés de «enzyme-linked immunosorbent assay»).

TÉCNICA ELISA
La técnica ELISA se basa en la detección de un antígeno 1 inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una reacción cuyo producto, por ejemplo un colorante,puede ser medido espectrofotométricamente. Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple en su realización, emplea reactivos económicos y mediante el uso de la fase sólida, consigue una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre. Además se han propuesto y desarrollado diferentes métodos de amplificación de la señal(luminiscentes, cascadas enzimáticas) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos ELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal. Fases de un ensayo ELISA Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes: 1. Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos,sandwich, etc. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno. 2. Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas. 3. Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la placa se puede detectar mediante unanticuerpo2 antiantígeno marcado (ELISA directo) o empreando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti-primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir uno o
Un antígeno es una molécula capaz de producir una respuesta del sistema inmune adaptativo mediante la activación de linfocitos.
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Los anticuerpos son proteínassintetizadas por células del sistema inmunitario de los vertebrados en respuesta a moléculasextrañas que denominamos antígenos.
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más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antígeno frío frente a unacantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de competición de antígeno. 4. Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todas las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante espectrofotometría.

Tipos de ensayos ELISA Se han desarrollado múltiplesvariantes de ensayos ELISA que permiten desde la cuantificación de un antígeno en solución, la detección de un anticuerpo en una solución (por ejemplo en el clonaje de anticuerpos monoclonales) o la determinación de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo. A continuación se describen los más comunes. · ELISA “Sandwich”. Es la modalidad usada con más frecuencia para la determinación de antígenos....