TRACCIÓN DE ADN, ENZIMAS DE RESTRICCIÓN, LIGACIÓN DE ADN Y ELECTROFORESIS A PARTIR DE MUESTRAS MICROBIANAS

EXTRACCIÓN DE ADN, ENZIMAS DE RESTRICCIÓN, LIGACIÓN DE ADN Y ELECTROFORESIS A PARTIR DE MUESTRAS MICROBIANAS


RESUMEN
Se realizó extracción de DNA (genómico y plasmídico) a partir de un cultivo de bacterias, el DNA genómico se extrajo por la técnica de fenol cloroformo y el DNA plasmídico utilizando el Kit Wizard Plus Minipreps DNA Purification System. Las enzimas de restricción tambiénconocidas como endonucleasas, cortan enlaces fosfodiéster a partir de una secuencia que reconocen. El objetivo de la técnica fue fragmentar una secuencia de ADN por medio de enzimas de restricción de forma específica. Son enzimas que solo se encuentran en procariotas. Después de este proceso se llevó a cabo la ligación de los fragmentos de ADN con T4 DNA Ligasa, ya que esta enzima permite la unióncovalente, por enlace fosfodiéster con el fin de digerir el ADN plasmídico y bacteriano. Para esto se tuvo en cuenta las concentraciones ideales y las condiciones específicas para las enzimas. PEQUEÑO RESUMEN DE LO QUE SE HIZO EN GEL DE AGAROSA. La electroforesis de SDS-PAGE, permitió observar las proteínas que se encontraban presentes en cada una de las muestras.


INTRODUCCIÓN
Lainformación genética en los seres vivos está contenida en las moléculas de ADN, macromolécula formada por unidades denominadas nucleótidos, los cuales contienen A, T, G, C. Existen diversos tipos de ADN, en bacterias se conocen dos tipos, genómico es aquel que está incluido en el único cromosoma existente en el citoplasma de las procariotas y que desempeña funciones metabólicas, fisiológicas y dereproducción, el otro tipo es el plasmídico, reconocido por su utilidad biotecnológica, donde los plásmidos son moléculas de ADN extracromosomal, de igual forma, poseen ADN de doble hebra, generalmente son circulares. La replicación de los plásmidos es independiente de la replicación del cromosoma del huésped.

El análisis de digestión o enzimas de restricción, son también llamadas comoendonucleasas, enzimas que cortan los enlaces fosfodiéster del materia genético a partir de una secuencias que reconocen. Son extraídas de organismos procariotas, donde actúan como mecanismos de defensa para degradar el material genético extraño que entra a la célula. Existen 3 tipos de enzimas de restricción, las Tipo I y IlI, tiene actividad de restricción y de modificación; las tipo I cortan lejos de lasecuencia de reconocimiento y las tipo lll cortan de 5 a 8 bases antes o después de la secuencia que reconocen. Las de Tipo II, sólo tienen actividad de restricción, requiriendo como cofactor Mg++ y sin necesidad de ATP. El análisis de restricción consiste en la fragmentación de una molécula de ADN mediante el uso de enzimas de restricción en puntos de características reconocidas y la corrida deestos fragmentos en un gel de agarosa para identificar el peso de cada fragmento y la reconstrucción del conjunto mediante el análisis de los fragmentos.

Las enzimas de DNA ligasas catalizan la síntesis de enlaces fosfodiéster entre un extremo fosfato 5’ y un extremo hidroxilo 3’ que estén cercanos y que hagan parte de un ADN de doble cadena. Durante los procesos de replicación, recombinación yreparación, corrige rupturas de enlaces fosfodiéster en el ADN de doble cadena. La combinación de las enzimas de restricción y las ligasas se constituyen en las principales herramientas para el acelerado desarrollo de tecnologías de DN recombinante. La enzima que se utiliza con mayor frecuencia es la T4 DNA Ligasa, la cual utiliza ATP, como fuente de energía para la reacción y es codificada porel gen 30 del bacteriófago T4.

La electroforesis es una técnica de separación de moléculas cargadas por migración en un campo eléctrico. Las moléculas se separan en función de su carga eléctrica, desplazándose al electrodo de carga contraria y a mayor velocidad cuanto mayor es la carga de la molécula. Los geles de poliacrilamida son el resultado de la polimerización química de una mezcla de...