Tranferencia humeda

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  • Publicado : 10 de marzo de 2011
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La transferencia húmeda es una técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en una muestra determinada.
El método para proteínas más potente es el denominado Western blot en el quelas proteínas son separadas en primer lugar mediante electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes y posteriormente se transfieren desde el gel de poliacrilamida a unamembrana adsorbente (típicamente de nitrocelulosa o de PVDF) para poder buscar la proteína de interés. Esta transferencia puede realizarse por difusión, por vacío o por acción de un campo eléctrico(electrotransferencia).
Este método tiene numerosas ventajas: proporciona mayor accesibilidad a las macromoléculas, las proteínas unidas a las membranas mantienen su antigenicidad y son accesibles asondas; se necesita un menor requerimiento de reactivos y un menor tiempo de reacción; utiliza soportes más maniobrables y proporciona un secado rápido.

Las membranas que se emplean en el Western blotse caracterizan por su capacidad de unir proteínas de forma inespecífica (es decir, se adhieren a todas las proteínas con idéntica afinidad):

• Las membranas de nitrocelulosa, aunque no se conoceexactamente la naturaleza de las interacciones membrana - proteína, se sabe con cierta seguridad que se trata de interacciones no covalentes de naturaleza hidrófoba. Proporciona la inmovilización deproteínas y ácidos nucleicos, ofrece distintos poros de utilidad (0,45 μm; 0,22 μm), proporciona una unión estable por interacciones hidrofóbicas (80-100 μg de proteína/cm2), las proteínas unidas a estamembrana pueden eluirse fácilmente con detergente, urea o pH y son resistentes a reacciones de tinción con solventes no acuosos.

• En las membranas de PVDF, la unión está basada en interaccioneshidrofóbicas y de dipolos entre la membrana y las proteínas. Como particularidad, deben ser humedecidas con metanol o etanol antes de exponerlas a tampones acuosos, debido a su alta hidrofobicidad y...
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