Transformación de escherichia coli con adn plasmídico

Introducción

Uno de los mecanismos por los cuales las bacterias intercambian material genético entre sí es el de trasformación. Éste consiste en la adquisición, por la bacteria, de ADN desnudo proveniente del medio extracelular. Dentro de ella el mismo puede ser degradado, incorporarse al genoma bacteriano por recombinación o, si se tratase de un plásmido, permanecer como tal. Cuando lasbacterias se encuentran en un estado fisiológico en el que son capaces de realizar transformación, se dice que son competentes. Dicho estado transitorio está asociado a un crecimiento rápido y falta de nutrientes.
En 1928, Frederick Griffith observó por primera vez el fenómeno de transformación experimentando con bacterias Streptocuccus pneumoniae. Trabajó con dos cepas de esta bacteria causante dela neumonía en ratones. Una de las cepas producía la muerte del ratón mientras que la otra no. Sabiendo esto, incubó un lisado de bacterias letales con bacterias inocuas vivas, con lo que luego inyectó a los ratones, los cuales enfermaron y murieron. Este experimento probó que había algo de las bacterias mortales que era tomado por las bacterias inocuas, transformándolas y volviéndolas letales.En 1944, Avery, MacLeod y McCarty, realizando diferentes tratamientos a los componentes de pneumococos letales muertos para luego continuar el experimento de Griffith, demostraron que aquel principio transformante era el ADN.

In vitro, se puede hacer competentes a las bacterias al incubarlas en un medio frío con el ADN plasmídico que se desea introducir y CaCl2. Esta técnica altera la paredcelular y permite que el ADN adsorba sobre la membrana bacteriana, la cuál tiene menor fluidez por efecto de las bajas temperaturas. Luego, se debe producir un shock térmico (pasaje brusco a 42ºC) durante 90’’ para que se formen poros en la membrana de la bacteria, por los que el DNA pasa al interior de la misma. Posteriormente, se debe dejar que las bacterias se estabilicen en un medio de cultivo(LB) sin antibiótico a temperatura óptima, para que comiencen a expresar el gen de resistencia al antibiótico determinado (que está contenido en el plásmido introducido) que permitirá seleccionarlas al plaquearlas en LB conteniendo dicho antibiótico. Cabe aclarar que el ADN plasmídico debe tener un origen de replicación para poder replicarse autónomamente dentro de la célula.

Descripción delexperimento

En este trabajo práctico se utilizó el ADN plasmídico extraído en el TP1.
Se trabajó con tres tubos eppendorf, cada uno con 50µl de bacterias competentes en hielo los cuales se rotularon 1, 2 y 3. Posteriormente, se agregó al tubo 1 5µl de agua esterilizada (control negativo), al tubo 2 5µl del plásmido control (control positivo), y al tubo 3, 5µl del plásmido obtenido en el TP1;estos tubos se dejaron en hielo durante 20 min. Para evitar la contaminación de las preparaciones con otras bacterias, esporas de hongos, etc. libres en el ambiente, toda manipulación de las mismas fue realizada en condiciones de esterilidad, cerca de una fuente de calor (mechero Bunsen).
Luego se realizó el shock térmico para que se formen poros transitorios en la membrana de las bacterias yentren los plásmidos. El mismo consiste en tomar del hielo los tubos y pasarlos inmediatamente a un baño a 42°C durante un minuto y medio indefectiblemente, para luego pasar al hielo nuevamente durante cinco minutos. Luego se agregaron 950µl de LB líquido a los tres tubos y se los mezcló por inversión para luego incubarlos en baño térmico durante 30 minutos a 37°C. El LB es un medio de cultivo quecontiene bacto-triptona 10g, extracto de levadura 5g, NaCl 5g y se le agrega agua hasta llegar a un litro; esta solución sirve para estabilizar a las bacterias (dado que vienen de un shock) y para que comiencen a expresar el gen de resistencia al antibiótico. Para concluir, se prepararon tres placas de Petri con LB sólido con ampicilina (antibiótico); luego, se agregó a cada una de ellas el...