E.Coli

1. Introducción:

La ingeniería genética ha sido definida como la formación de nuevas combinaciones de material heredable mediante la inserción de moléculas de ácidos nucleicos- producidas por cualquier medio externo a la célula- en virus, plásmidos bacterianos u otros sistemas de vectores, de modo que permita su incorporación en un organismo huésped, en el cual dicho proceso noocurriría de forma natural (1)

Las técnicas más utilizadas en la modificación genética son: la biobalística (vegetales), la microinyección (animales), transformación artificial mediante plásmidos (bacterias), y la que se utilizó en el laboratorio, la electroporación, la cual consiste en aumentar la conductividad eléctrica y la permeabilidad de la membrana plasmática celular, causado por un campoeléctrico aplicado externamente, es decir, altera la conformación estructural de la membrana plasmática de la célula (E. Coli) mediante el uso de pulsos eléctricos, lo cual permite el ingreso del plásmido que contiene el gen deseado de la resistencia a la ampicilina y un gen marcador que muestra a las bacterias que fueron efectivamente transformadas, generando colonias azules.

Para ver laefectividad de la modificación genética, se llevó a cabo una siembra en placas de cultivo LB, que es un medio rico en nutrientes, en donde las bacterias se multiplican con rapidez. Además este medio contenía ampicilina, que es un antibiótico betalactámico dado que contiene un anillo β-lactámico en su estructura molecular (2). La ampicilina es capaz de penetrar bacterias Gram positivas y algunas gramnegativas y anaerobias. Inhibe la síntesis de la pared celular de la bacteria en sus últimas dos etapas. Por otro lado, Xgal es un sustrato cromogénico para la β-Galactosidasa que forma un precipitado de color azul intenso. Como resultado obtendremos bacterias no transformadas que no crecerán en la placa dado que son sensibles a la ampicilina y por el contrario las bacterias que contengan el plásmidocrecerán formando colonias de color azul (son resistentes a la ampicilina y tienen actividad β-galactosidasa.




2. Objetivos

➢ Comprender los eventos que involucran la generación de un organismo modificado genéticamente.
➢ Observar las consecuencias de la modificación genética de un microorganismo.
➢ Realizar la transformación genética de una bacteria.


3. Materiales y métodosMateriales:
Células competentes de E. Coli cepa DH5 alfa, Plásmido pBlueScript SK, Pipetas, Micropipetas, Medio LB líquido, Medio de cultivo LB con ampicilina y x-gal, Electroporador, Cubetas para electroporar, Tubos Eppendorf, Puntas para micropipetas, Agua ultra pura, Placas de cultivo.

Método:

• Se tomaron 100 uL de células competentes de la bacteria y se depositó en una cubeta deelectroporación.
• Se agregó también 1 uL del plásmido a la cubeta de electroporación.
• Se puso la cubeta en el equipo para electroporar y se puso en funcionamiento el equipo. La muestra inoculada fue sometida a 1.8 Kv por 5.8 milisegundos.
• Se agregó 1 mL de medio de cultivo LB a la cubeta, se agitó, para luego con una pipeta diferente transferir a un tubo eppendorf estéril previamente rotulado.• Se incubaron los tubos a 37 ºC por 30 minutos.
• Se tomó 0.1 mL de cada transformación y se depositó sobre una placa de cultivo LB que contenían ampicilina y x-gal.
• Se incubaron las placas a 37ºC hasta la próxima sesión.
• Se debió observar y cuantificar crecimiento de colonias azules en la placa de cultivo.
4. Resultados:
Tabla Nº 1: Número de colonias en las placas
|Placa|Colonias que crecieron (azules) |
|Nº 1 |19 |
|Nº 2 |26 |
|[pic] |23.5 |

➢ Número total de transformante: colonias que crecieron x 10 =...