12312

Practica No.10
Bilirrubina total y directa para la determinación cuantitativa colorimétrica de Bilirrubina directa y total en suero o plasma humano.
Introducción:
La mayoría de losprocedimientos clínicos de rutina para la determinación de bilirrubina sérica, están basados en la clásica reacción Diazo de Ehrlich, la cual se aplicó primero a la estimación de estos pigmentos biliares en sueroen 1913 por Van den Berg y Snapper. Winkelman y colaboradores proporcionaron una revisión excelente de muchas metodologías de bilirrubina.
Fundamento:
La bilirrubina reacciona específicamente conel ácido sulfaníli-co diazotado produciendo un pigmento color rojo-violáceo (azo-bilirrubina) que se mide fotocolorimétricamente a 530 nm.Si bien la bilirrubina conjugada (directa) reaccionadirectamen-te con el diazorreactivo, la bilirrubina no conjugada (indirecta)requiere la presencia de un desarrollador acuoso que posibilitesu reacción. De forma tal que, para que reaccione la bilirrubinatotal(conjugada y no conjugada) presente en la muestra, debeagregarse benzoato de cafeína al medio de reacción.Cuando una solución de ácido sulfanílico en ácido clorhídrico diluido es combinada con nitritode sodio, se forma ácido nitroso. Este ácido inestable, el cual debe ser preparado en el momento del ensayo, reacciona para formar ácido sulfanílico diazotizado. Este último (también llamado“p-bencendiazonio sulfonato”) se acopla con la bilirrubina para producir azobilirrubina, la intensidad de color de este es proporcional a la concentración de bilirrubina. Ya que los estándares de bilirrubinasufren una gran degradación por su inestabilidad, el método presentado utiliza una solución acuosa de N-1-naftiletilendiamina dihidroclorhídrico como calibrador, de acuerdo con Bilissis y Speer. Estaamina aromática estable pura se acopla con el ácido sulfanílico diazotizado bajo las condiciones de prueba para dar un colorante azo con cualidades espectrales similares a la azobilirrubina...