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LABORATORIO Nº4
Enzimología 1.
Caracterización de la Fosfatasa Ácida de Aorta de Bovino; efecto del pH y de la temperatura

Introducción
Las enzimas son catalizadores biológicos, que aumentan la velocidad de una reacción, disminuyendo la energía de activación de la misma. Se caracterizan por medio de Km: constante de Michaelis-Menten y de la Vmáx: velocidad máxima de reacción. La velocidadde una reacción se puede estimar:
a) midiendo la desaparición de sustrato en el tiempo o
b) midiendo la aparición de producto en el tiempo.
El termino fosfatasa se utiliza para describir a aquellas enzimas que catalizan la hidrólisis de derivados del ácido ortofosfórico. Dependiendo del tipo de enlace que se hidroliza se clasifican en:
a) Fosfomonoesterasa (enlace fosfoester)
b)Fosfodiesterasa (enlace fosfodiester)
b) Anhídrido fosfórico hidrolasa (enlace pirofosfato).
Las fosfomonoesterasas se clasifican en específicas (un único sustrato) y no especificas (reconocen a varios sustratos distintos). Estas últimas, a su vez, dependiendo del pH óptimo, se clasifican en alcalina o ácida.
Las fosfatasas están presentes en prácticamente todos los órganos animales. Se encuentraninvolucradas en el metabolismo de carbohidratos, ácidos nucleicos, fosfolípidos y en la formación de los huesos.
En este práctico se estudiará una fosfomonoesterasa no específica que se extraerá de la aorta de bovino y cuyo pH óptimo está en el rango ácido (fosfatasa ácida).

Mecanismo de reacción:

En este práctico se usará como sustrato p-nitrofenilfosfato el que al hidrolizarse generapara-nitrofenol. Este compuesto a pH alcalino presenta un color amarillo el cual puede ser cuantificado por espectrofotometría a 410 nm. A esta longitud de onda el coeficiente de extinción molar, eM, es = 17500 M-1 cm-1.
Para determinar la concentración del producto coloreado, se mide la absorbancia a 410 nm, frente a un blanco que contiene todos los reactivos menos el sustrato. Aplicando la ley deLambert y Beer, se calcula la concentración molar del producto formado. Ley de Lambert - Beer : A = e·c·l, donde A es la absorbancia, e es el coeficiente de extinción molar, c es la concentración en moles/L y l es el diámetro de la celda. La velocidad de reacción se obtiene al relacionar la cantidad de producto formado en el tiempo, mediante la siguiente ecuación: V = [p-nitrofenol] / Dt. Donde v esla velocidad de la reacción enzimática, Dt es el tiempo de incubación.
Para determinar los parámetros característicos de una enzima con comportamiento de Michaelis Menten, se realiza el estudio del efecto de la concentración de sustrato frente a la velocidad de la reacción. En un principio se observa que al aumentar la [S] aumenta la velocidad de reacción, hasta que llega un momento en queaunque se aumente la [S], la velocidad se mantiene constante. Esta es la Vmáx y se alcanza cuando la enzima se satura con sustrato:

Sin embargo la determinación de Km y Vmáx desde este gráfico no es muy adecuada, ya que se requiere de gran cantidad de puntos para construir la zona curva. En cambio si se tratará de una línea recta, esta queda determinada con tres puntos y es más fácil, extrapolar ointerpolar, o calcular una pendiente o una intersección. Es así como Lineweaver y Burk, linealizaron el comportamiento de Michaelis-Menten obteniendo una recta que queda representada en el siguiente gráfico:

Objetivos
* Cuantificar la velocidad de una reacción enzimática
* Aplicar los conceptos teóricos adquiridos en la caracterización de una enzima.
* Encontrar el pH y la temperatura optimade la fosfatasa ácida de aorta de bovino
* Determinar Km y Vmáx de la fosfatasa ácida de aorta de bovino gráficamente y de la
ecuación de la recta
* Cuantificar la velocidad de la reacción enzimática en presencia de un inhibidor
Materiales por Grupo Reactivos
30 tubos de ensayos solución tampón citrato pH: 3; 4,5; 5,6; 7,5; 9.
3 gradillas solución p-nitrofenilfosfato 30 mM
1 juego de...