2

Materiales y métodos

II. MATERIALES Y MÉTODOS

61

Materiales y métodos

62

Materiales y métodos

1. CITOQUINAS Y COMPUESTOS
1.1. FACTOR DE NECROSIS TUMORAL-ALFA (TNF-α
α)
PeproTech ECLTD Cat# 315-01A Lote: 01154. Se utilizó TNF-α recombinante
murino, siempre el mismo lote de la citoquina. Se reconstituyó en agua bidestilada
(H2Obd) estéril y se repartió en alícuotas de 10 µl de 100 ng/µl y25 ng/µl. Dichas
alícuotas se conservaron a -80oC y se permitió como máximo un ciclo de congelación y
descongelación.
1.2. SP100030
Este compuesto fue donado por la empresa Signal Pharmaceuticals (San
Diego). Su fórmula química es 2-cloro-4-(trifluorometil)pirimidina-5-N-(3’, 5’bis(trifluorometil)fenil)-carboximida. El compuesto se mantuvo liofilizado a 4ºC hasta su
utilización.
1.3. GW1929
Estecompuesto,
cuya
formula
es
(N-(2-benzofenil)-O-[2-(metil-2piridinilamino)etil]-L-tirosina), se obtuvo de la empresa Sigma (Cat# G5668). El
compuesto se mantuvo liofilizado a 4ºC hasta su utilización.
1.4. RU486
Este compuesto fue donado por el Dr. D. Philibert (Rousel Uclaf, Romain Ville,
Francia). Se mantuvo liofilizado a 4ºC hasta su utilización.
2. ESTUDIOS IN VIVO
2.1. ANIMALES Y CONDICIONES DEESTABULACIÓN
Los experimentos presentados se realizaron con dos especies de animales
diferentes: ratas Wistar (Interfauna, Barcelona) y ratones C57BL/6 (Criffa, Barcelona).
Los animales se mantuvieron estabulados en condiciones ambientales estándar (22 ±
2oC de temperatura, humedad relativa del 70-80%, ciclo de iluminación de 12 horas
diarias de luz), con libre acceso al pienso y al agua. La dieta(B.K. Universal G.J./S.L.,
Sant Vicenç dels Horts) estaba constituida por un 45,5-48,5% de hidratos de carbono
(3,5% glucosa absorbible, 43-45% almidón), 18,5% de proteína y 3,1% de grasa.
2.2. MODELOS EXPERIMENTALES DE TUMOR
Se utilizaron dos modelos tumorales altamente caquécticos: el hepatoma
ascítico Yoshida AH-130 (en rata), y el carcinoma pulmonar de Lewis (en ratón).
Ambos se mantuvieronmediante la inoculación del tumor de un individuo a otro en
nuestra colonia del estabulario de forma permanente, obteniéndose para la realización
de los experimentos muestras de tumor en fase de crecimiento exponencial.
2.2.1. HEPATOMA ASCÍTICO YOSHIDA AH-130
El hepatoma ascítico Yoshida AH-130 es un tumor de rápido crecimiento
(tiempo de duplicación de 24 horas) que contiene células pocodiferenciadas y que
causa, en las ratas portadoras, una rápida pérdida de peso corporal y del contenido
proteico del músculo esquelético, así como otras importantes alteraciones metabólicas
(Baccino et al., 1984).
63

Materiales y métodos

Las células tumorales fueron recogidas con una jeringa estéril directamente de
la cavidad peritoneal de una rata con tumor en fase exponencial (7 días después de lainoculación), se diluyeron en PBS estéril a una concentración de 104 células/ml y se
inocularon 2 ml (108 células) a cada una de las ratas del grupo de portadoras de
tumor, inyectándoselas intraperitonealmente. Al final del periodo experimental se
recogió el tumor de la cavidad peritoneal y se midió su volumen en una probeta
graduada. En un eppendorf se mezcló, en el siguiente órden; 875 µl de PBS,100 µl de
azul Tripano y 25 µl de suspensión de células tumorales; se agitó suavemente, y se
pusieron 20 µl en la gradilla del hematocitómetro. Se contaron las células en 6
cuadritos de cada uno de los cuadrantes (X) y se calculó la media de los 16. El número
de células se calculó de la siguiente forma;
X x 16 x 40 (factor de dilución) x 104 = número de células / ml
Teniendo en cuenta que la sumade los 16 cuadritos representa un volumen de 0,1
mm3.

Para los experimentos de transferencia génica con adenovirus se usó una
cantidad menor de células tumorales, debido a que los animales para este
procedimiento eran más pequeños que los utilizados en los restantes tratamientos. La
cantidad de células tumorales inoculadas fue en este caso de 40 millones,
resuspendidas en 1 ml de PBS (4x107...