2011 Funcion Mitocondrial 1

Brenda Fina

TECNICAS PARA EL ESTUDIO DE LA FUNCION MITOCONDRIAL
1. Aislamiento de mitocondrias
Las mitocondrias se aíslan como estructuras intactas, con su doble membrana. Los órganos (hígado yriñón)
se pesan y se colocan en una solución amortiguadora MSTE, en una proporción de 9ml/g órgano. Se
realizan sucesivos cortes y lavados de los órganos, y se homogeneizan utilizando un homogeneizador deteflón. Los homogeneizados se centrifugan a 700g durante 10 minutos para descartar núcleos y membranas
celulares. Posteriormente, el sobrenadante se centrifuga a 8000g durante 10 minutos. El nuevopellet es
lavado y resuspendido en la misma solución amortiguadora, y consiste principalmente en mitocondrias
intactas. Las centrifugaciones se realizan a 2-4°C [i,ii].
2. Determinación del consumo deoxigeno
La velocidad de consumo de oxígeno se determina utilizando el electrodo de Clark, adosado a una cámara
de incubación con un baño termostatizado de circulación y con agitación constante. Elelectrodo de oxígeno
realiza lecturas polarográficas de forma continua del consumo de oxígeno en el interior de la cámara de
incubación cerrada con una tapa de vidrio esmerilada. El electrodo de Clark midela presión de oxígeno en
forma de corriente eléctrica a un voltaje de polarización constante (0,6V vs. Ag/AgCl). Esta corriente es
directamente proporcional a la presión parcial del oxígeno (pO2) quedifunde a la superficie reactiva del
electrodo. Los datos se obtienen con un software específico.
La respiración mitocondrial se evalúa en los estados 3 (alto contenido de ADP y sustrato) y 4 (bajocontenido
de ADP y alto de sustrato) para calcular el control respiratorio (Velocidad en estado 3/estado 4). El mismo es
función del grado de acoplamiento mitocondrial y es un indicador de la integridadmitocondrial.
Además, se pueden agregar distintos inhibidores o desacoplantes de la cadena respiratoria para evaluar el
grado de inhibición de la misma.

3. Velocidad de producción de ATP
La...