239247216 Patch Clamp

MÉTODO DE PATCH-CLAMP

Es una técnica electrofisiológica para medir corriente eléctrica que pasa a través de la membrana en un canal sencillo en células.
La técnica de patch clamp (desarrollada por Nher y Sakmann) usa un micropipeta de vidrio de diámetro suave con una abertura de aproximadamente 1um. La eficiencia de esta técnica requiere que la membrana esté libre, es decir, separada de otrascélulas, libre de tejido conjuntivo, de restos celulares, etc, para que de esta forma, la pipeta se pueda adherir de una manera eficiente a la membrana celular.
Las pipetas son preparadas a partir de capilares de vidrio de borosilicato y confeccionadas a través de un puller, el cual es programado para dividir el capilar en dos, generando así en el sector de la división, finísimas puntas, las quemás tarde serán refinadas con calor para suavizar el contorno, lo que también permitirá una mejor adhesión del vidrio a la membrana.
Esto contrasta con microelectrodos nítidos que se usan con frecuencia en otras técnicas electrofisiológicas. La pipeta se llena con una solución que depende del estudio específico o la técnica de patch clamp usada. Un electrodo de metal en contacto con esta soluciónconduce cambios eléctricos a un amplificador de voltaje. Este está presionado contra la membrana celular y se aplica succión para absorber la membrana dentro de la pipeta con el eléctrodo para formar un sello eléctricamente apretado de “giga-ohm”. En el patch clamp un solo electrodo se usa para hacer el patch clamp de la membrana celular habilitando el mantener el voltaje en un nivel constantemientras que se graban los cambios de corriente. En forma similar, la corriente en la célula puede ser anclada a la corriente y grabar los cambios de voltaje. Hay algunas variantes de la técnica de patch clamp que se pueden realizar incluyendo, por ejemplo:
Patch Clamp Planar: en lugar de pipetas de vidrio, se usa una superficie plana puncionada con pequeños hoyos.

Patch “cell Attached”(Célula-pegada): el electrodo se mantiene sellado a la membrana celular mientras que la solución en la pipeta se altera (por ejemplo, por la adición de drogas) y se graba la actividad de los cambios resultantes.
Presionando la pipeta de Patch sobre la superficie limpia de una célula se le aplica una succión suave, pudiendo lograr de esta manera un sello en el orden de los 6Ω. En estas condiciones se puedenaplicar diferentes estímulos a la fracción de membrana desde el interior de la pipeta y medir las respuestas de los canales aislados.

Patch “inside out” (De adentro hacia fuera): Donde el área “succionada” de la membrana se desprende de la célula y se expone a la superficie intracelular de la membrana – la que en cambio se puede exponer a varios medios conteniendo, por ejemplo, varios ligantesintracelulares.
Una vez establecido el sello, en vez de aplicar estímulos inmediatamente se puede separar la fracción de membrana sellada y exponer la abertura inferior de los canales.

Patch “whole cell” (De célula completa): Donde se incrementa la succión rompe la membrana y brinda acceso del electrodo al ambiente intracelular por un periodo de tiempo corto, el ambiente intracelular es diluido porlos contenidos de la pipeta.
Se rompe la fracción de membrana sin destruir el sello para exponer de esta manera el interior de la célula o del organelo.

Existe otra configuración llamada “Outside Out” (Del exterior hacia afuera) que es equivalente a la célula completa en el sentido de que el interior de la membrana queda expuesto al contenido en la pipeta y el exterior de la misma es expuesta almedio exterior.
Las diferentes configuraciones del patch clamp, faculta al investigador a:
Estudiar los canales iónicos en diferentes niveles, por ejemplo, se puede tanto utilizar la técnica de whole cell (célula completa) para analizar la actividad de todos los canales de la célula como realizar registros de canal único.
Manipular fácilmente la composición tanto del medio extracelular como del...