27 MÉTODOS PARA LA CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

27. Métodos para la cuantificación de proteínas
Emilio Fernández Reyes y Aurora Galván Cejudo
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales,
Edificio Severo Ochoa, 14071-Córdoba

RESUMEN

En esta práctica se utilizaran tres métodos para la cuantificación de
proteínas: Biuret, Bradford y BCA. Para cada uno de los métodos se
realizaran: una curva estándar, elcálculo del coeficiente de extinción y el
rango de sensibilidad. Se realizará la cuantificación de dos muestras
problemas de baja y alta concentración, respectivamente, y se discutirá
las ventajas e inconvenientes de cada uno de los métodos.
Palabras clave: cuantificación de proteínas, Biuret, Bradford, BCA
Abreviaturas: BCA: ácido bicinconínico

1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
1.1

Métodos parainconvenientes

la

cuantificación

de

proteínas:

ventajas

e

Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una
técnica de rutina básica cuando se aborda un esquema de purificación de una
proteína concreta, cuando se quiere conocer la actividad específica de una
preparación enzimática, para el diagnóstico de enfermedades, así como para
otros muchos propósitos.
Existen diferentesmétodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de
estos métodos se basan en: a) la propiedad intrínseca de las proteínas para
absorber luz en el UV, b) para la formación de derivados químicos, o c) la
capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes. En la Tabla I se
recogen los métodos más usados así como sus respectivas sensibilidades.
Cada uno de estos métodos tiene susventajas e inconvenientes, las
principales se recogen en la Tabla II.

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Tabla I. Principales métodos para la cuantificación de proteínas y sus rangos de
sensibilidad
Método
Métodos de
Absorción
A280
A205
A280 - A260
A235 - A280
A224 - A236
A215 - A225
Métodos Derivados
Colorimétricos
Biuret
Lowry

Bradford
BCA
Métodos Derivados
Fluorimétricos
o-ftalaldehido

Rango de sensibilidad
(µg)

Coeficiente deextinción o Cálculo de la
concentración
ε280 = 1 mL/mg cm
ε205 = 31 mL/mg cm
Proteína (mg/mL) = (1.55A280 – 0.76A260)
Proteína (mg/mL) = (A235 – A280)/2.51
Proteína (mg/mL) = (A224 – A236)/0.6
Proteína (µg/mL) = 144(A215 – A225)

100-3000
3-100
100-3000
25-700
5-180
2-45

1000-10000
25-100 a 500 nm
2-30 a 660 nm
1-2 a 750 nm
1-15
0.5- 10
1-5 λexcitación a 340 nm
λemisión a 475 nm

ε545 = 0.06mL/mg cm
Usar curva estándar
ε595 = 81 mL/mg cm
Usar curva estándar

Usar curva estándar

Tabla II. Principales métodos para la cuantificación de proteínas, principales ventaja e
inconvenientes
Método
Métodos de
Absorción
Métodos Derivados
Colorimétricos
Biuret

Lowry

Bradford
BCA

Métodos Derivados
Fluorimétricos
o-ftalaldehido

Ventajas
No se pierden las
muestras

Inconvenientes
Interfieren muchoscompuestos que absorben
en el UV

Bastante específico para
proteínas
Muestra pocas
interferencias
Es barato
Tiene bastante
sensibilidad

Tiene poca sensibilidad

Muy sensible
Es el método mas sensible
Es el que muestra menos
interferencias

Muy sensible

No todas las proteínas reaccionan igual
Mustra muchas interferencias como
detergentes no iónicos, sulfato amónico etc.
Muestra interferenciascon detergentes

La interferencia de aminas contaminantes en
la muestra
No todas las muestras reaccionan igual

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1.2. Método de Biuret
Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los
grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con
4 NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad
de proteínas (enlaces peptídicos) y lareacción es bastante específica, de
manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy
baja y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados
muy concentrados (por ejemplo en suero).
1.3. Método de Bradford
Se basa en la unión de un colorante, Comassie Blue G-250 (también
Serva Blue) a las proteínas. El colorante, en solución ácida, existe en dos
formas...