2d Determinacion De Proteinas

DETERMINACIÓN DE
PROTEÍNAS
A. LEY DE LAMBER Y BEER
B. CURVA PATRÓN
C. MÉTODO UV: ABS 280NM
D. MÉTODOS COLORIMÉTRICOS:
BIURET, LOWRY, BRADFORD, BCA.
Comparación de métodos

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
 Determinar

la concentración de proteínas en
una muestra biológica es una técnica de rutina
básica cuando se aborda un esquema de
purificación de una proteína concreta, cuando
se quiere conocerla actividad específica de
una
preparación
enzimática,
para
el
diagnóstico de enfermedades, así como para
otros muchos propósitos.

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS


a)
b)
c)

Existen diferentes métodos para la
cuantificación de proteínas. Muchos de
estos métodos se basan en:
la propiedad intrínseca de las proteínas
para absorber luz en el UV,
para la formación de derivados químicos, o
la capacidadque tienen las proteínas de
unir ciertos colorantes.

LEY DE LAMBERT - BEER
Relaciona la absorción de luz con 

las propiedades del material 
atravesado.

LEY DE LAMBERT Y BEER
La ley explica que hay una relación
exponencial entre la transmisión de luz a
través de una sustancia y la concentración
de la sustancia, así como también entre la
transmisión y la longitud del cuerpo que la
luzatraviesa.
 Si conocemos l y A, la concentración de la
sustancia puede ser deducida a partir de la
cantidad de luz transmitida.


A = ε·c·l
Donde:
 A = absorbencia
  = Coeficiente de extinción molar.
 l = longitud de la celda.


COEFICIENTE DE EXTINCIÓN MOLAR


Es una medida de la cantidad de luz
absorbida por unidad de concentración.



Un compuesto con un alto valor de
coeficiente deextinción molar es muy
eficiente en la absorción de luz de la
longitud de onda adecuada y, por lo tanto,
puede detectarse por medidas de absorción
cuando se encuentra en disolución a
concentraciones muy BAJAS.

MÉTODOS PARA DETERMINAR
PROTEÍNAS


Intervalo del UV
Todas la proteínas pueden ser detectadas, sin
embargo solo ciertos residuos de
aminoácidos son los que se leen en la región
del UV.



Porreacciones colorimétricas:
Enlaces peptídicos o ciertos aminoácidos
reaccionan y los productos coloridos son los
que se cuantifican

PROTEÍNAS Y LA ABSORCIÓN EN
LA REGIÓN UV
Las bandas de absorción más significativas
se encuentra en el ultravioleta cercano, en el
intervalo de longitud de onda entre 230 y
300 nm.
 Concretamente absorben en este rango las
cadenas laterales de los aminoácidosaromáticos, la histidina y la cistina.
 La cistina presenta una banda centrada a
250 nm, n-->s* (max ~ 300 M-1.cm-1), pero
apenas se puede considerar, ya que es muy
débil y el porcentaje relativo de puentes
disulfuro es muy pequeño en una proteína.


PROTEÍNAS


Los aromáticos absorben de 260-290 nm. La

fenilalanina. Es el menos importante cuantitativamente,
aunque muestra un espectro complejocon múltiples
bandas diferenciadas en torno a 250-260 nm. Presenta
también bandas de mayor energía que solapan con el
espectro del enlace peptídico en 215 y 180 nm. Sin
embargo como no absorbe por encima de 280 nm su
contribución al espectro en la zona del ultravioleta cercano
de proteínas suele ser pequeña.


La tirosina presenta un máximo a 275 nm con
un hombro a 285 nm. La banda se desplaza amayores
longitudes de onda cuando se produce la desprotonación
del OH del anillo aromático.



El triptófano agrupa al menos tres bandas
diferentes.bajo el espectro centrado a 280 nm. También
presenta bandas en la zona del UV lejano.

CALCULAR LA CONCENTRACIÓN DE
PROTEÍNAS: MÉTODO UV
Se usará la ecuación de Lambert y Beer.
 El coeficiente de extinción molar de la
Albumina de Suero Bovino (BSA)que es 43
824 M-1 cm-1 o bien usando el coeficiente
dado en porcentaje que es de 6.6 para una
solución de BSA al 1% (10 mg/mL)
 La fórmula para determinar la concentración
de la muestra.




DESARROLLO EXPERIMENTAL
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL
MÉTODO ABS 280 NM.
1.

2.

3.

4.

 Descongelar sólo las alícuotas de las
fracciones de proteína destinadas para este
protocolo y que fueron...