3 Ecologà a Microbianaa

TÉCNICAS MOLECULARES
APLICADAS AL ESTUDIO DE LOS
MICROORGANISMOS EN EL
AMBIENTE

Genómica
Traditional Microbial Genomics

isolate individuals

cultivation

prepare DNA, sequence randomly

assemble genome

La evolución de la Genómica
Los 90s: Análisis del proteoma y genoma basados en homology (función
molecular ).
Actualmente
~800
genomas
terminados:
272 bacterias
25 Arqueas

MetagenomicaTraditional Microbial Genomics

Environmental Genomics

prepare DNA, sequence randomly
isolate individuals

cultivation

prepare DNA, sequence randomly

assemble (partial) genomes
assemble genome

Bases de datos existentes:

Underground
Mine Biofilm

Surface
Sea Water

Farm Soil

Deep Sea
Whale Skeleton

~100 Mb

> 1400 Mb

> 100 Mb

~75 Mb

1

7

1

70,000

> 1 Mio

180,000

120,000

ORFs

>85%~60%

<1%

~40%

Assembled

Tyson, Nature 04

Venter, Science 04

Tringe, Nature 05

3

Sequence*
Subsamples

Tringe, Nature 05 Reference
(* quality filtered)

“El 2nd proyecto del metagenoma humano, 2004”

Secuencias novedosas….
En general < 50% de secuencias ambientales tienen homólogos conocidos

Metagenómica y función

Para predecir la función de genes nuevos!

Sargasso Sea contigs:Conserved
uncharacterized
Protein (hydrophobic)

…

La composición del genoma y el ambiente

Sargasso sea: 34% GC
Minnesota soil: 61% GC
Whale falls: 48 % GC
Acid mine: 47 % GC

GC content

Foerstner et al. (2005) EMBO reports

The environment and species composition

von Mering et al., unpublished

0.1

and the genome size

0.22

0.8

3.0

20.0

10

Sample 5 - Hydrostation S
8.70 Mbp

7.41 Mbp

8Sample 1 - Station 11/13
4.14 Mbp

4.47 Mbp

4

5.09 Mbp

Sample 6 - Hydrostation S
5.71 Mbp

4.36 Mbp

6

3.50 Mbp

SOIL

Sample 7 - Hydrostation S
1.79 Mbp

WF3

AMD

2

WF2

Sample 3 - Station 3 - 2.23 Mbp
Sample 4 - Station 13 - 2.11 Mbp
Sample 2 - Station 11/13 - 1.99 Mbp
WF1

Predicted Effective Genome Size (Mbp)

The environment

0
0.1

Raes et al., unpublished

1

10

Filter pore size ( m)Análisis del metagenoma! Pero??
• 1000s de especies con grados diferentes de dominancia
•
•
•
•
•

ecológica
El secuenciamiento no es exhaustive, así que hay
genomas incompletos y medio ensamblados
Lecturas cortas (no ensamblan) con genes incompletos
Demasiados datos y donde los analizo?
Y las muestras? Sesgos y contaminación
Antes de estudiar la comunidad también debemos
conocer parámetrosambientales de donde viven las
comunidades.

Extracción de ADN
 Calidad y cantidad
 Nanodrop y Qubit
 La relación 260/280 = 1.8 puro sino hay

proteínas, fenol, guanidina, beads magnéticas,
carbohidratos.

PCR

Y CLONAMIENTO

Marcadores taxonómicos moleculares:
RNA ribosomal subunidad pequeña SSU-16S procariotes
RNA ribosomal subunidad grande LSU-23S procariotesRegión transcrita interribosomal (ITS)y LSU 28S – Eucariotas y hongos.
RNA polimeraza (rpoB, RPB1)
Citocromo C y genes funcionales.

Métodos de “fingertyping”
 Electroforesis en gel de gradiente
denaturante (DGGE)
 Electroforesis en gel de gradiente de

temperatura (TGGE)
 Polimorfismo de los fragmentos de
restricción terminal (TRFLP)
 Análisis de restricción del DNA ribosomal
amplificado (ARDRA)
 Análisis del espaciadorintergénico ribosomal
automatizado (ARISA).

Electroforesis en gel de gradiente
denaturante- DGGE


Comparación de poblaciones microbianas

Gel poliacrilamida 6%

DGGE
•

•
•

Patrones de banda o huellas de cada
muestra ambiental.
La diversidad de bandas = UTO, filotipo
o ribotipo.
La diferencia entre estos patrones es
determinada por la ausencia o
presencia de bandas para construir
dendrogramas.

Gelpoliacrilamida 6%

30%
50%

Dendrogramas y filogenia

Tomado de Hou et al. 2012.

T-RFLP

O GENES FUNCIONALES

CORTAR CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Tamaño pb

T-RFLP ANALYSIS



ABI 310 para análisis de secuencias de
hasta 1000 pb

MspI

HhaI

Tamaño de cada fragmento en pares de bases

Electroferogramas

Análisis de la data

PCR cuantitativo de genes
(qPCR) o real time PCR
(rt-PCR)....