3 Vectores

Ingeniería Genética 1
2do Cuatrimestre 2014
Dra. Diana Costa
Lic. Leandro Guttlein
Dra. Julieta Panero

Esquema general clonado molecular
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Análisis del objetivo
Diseño in silico
Aislamiento de la plataforma
Aislamiento del inserto
Apertura de la plataforma
Compatibilización de extremos
Ligación
Transferencia horizontal
Selección/Screening

Plataformas de clonado
Moléculas deacido nucleico con capacidad de
replicarse en algún microorganismo y permitiendo a
la vez insertarle secuencias no propias.

REQUISITOS

1. Replicación dentro del huésped
2. Recibimiento de secuencias heterologas
3. Selección de recombinantes

Plataformas de clonado

Plataformas de clonado

Plásmidos
Moléculas de dsDNA extracromosómicas, generalmente
circulares covalentemente cerradas, concapacidad
autónoma de replicación

Incompatibilidades
Plásmido

Replicón

Nº de copias/célula

Serie pBR

pMB1

15-20

Serie pUC

pMB1 mut

500-700

pBluescript

ColE1

15-20

pSC101 y derivados

pSC101

1-5

pACYC y derivados

p15A

10-12

Dos plasmidos que compartan los mismos
elementos replicativos no coexisten en la
misma célula en ausencia de presión
selectiva

Más de 30 grupos deincompatibilidad

Incompatibilidades
Plásmido

Replicón

Nº de copias/célula

Serie pBR

pMB1

15-20

Serie pUC

pMB1 mut

500-700

pBluescript

ColE1

15-20

pSC101 y derivados

pSC101

1-5

pACYC y derivados

p15A

10-12

Dos plasmidos que compartan los mismos
elementos replicativos no coexisten en la
misma célula en ausencia de presión
selectiva

Más de 30 grupos de incompatibilidad

Plataformas declonado:
Plasmidos

Mecanismo de control
“Relajado” (pMB1 y ColE1)
En el estado “relajado” el
plásmido
replica
libremente
generando entre 15- 20 copias por
célula.
La proteína Rop actúa como
dímero. Facilita la interacción de
RNA I y RNA II de manera de
inhibir el priming producido por
RNA II (prom constitutivo).

Mecanismo “estricto” (pSC101)
Solo se replica una vez o un pequeño
numero de veces encada ciclo
celular, dependiente de proteínas
activadoras, inhib. por cloranfenicol

Ejemplos de antibióticos empleados

Kanamicina: inhibe la traducción
Cloranfenicol: inhibe la traducción (50S)
Tetraciclina: inhibe la traducción (30S)
Ampicilina: inhibe síntesis pared bacteriana

- Ampicilina : Inhibe la síntesis de pared bacteriana. El gen que
otorga resistencia bla o ApR, codifica para laβ-lactamasa. Se
secreta al espacio periplásmico
- Tetraciclina: Se une al Ribosoma (30S). El gen TcR codifica para
una proteína asociada a membrana. Este impide la entrada del
antibiótico!
- Kanamicina. Interactúa con componentes ribosomales inhibiendo
la traducción. El gen que confiere la resistencia es KmR y funciona
fosforilando el antibiótico
- Neomicina: Ídem a la Kanamicina (gen NeoR). Ambospertenecen
al grupo de los aminoglicósidos
- Cloranfenicol: Interactúa con el ribosoma (50S) inhibiendo la
síntesis de proteína. El gen CmR (proveniente del Tn9) codifica
para una acetiltransferasa capaz de modificar el antibiótico
irreversiblemente.
- Otros antibióticos utilizados: Higromicina B y Estreptomicina

Plásmidos
• Excelentes plataformas que pueden ser multiplicados en
bacterias yseleccionados verticalmente debido a que
aportan ventajas (ej. Resistencia a AB).
• Bacterias: organismos fáciles de multiplicar en condiciones
de laboratorio. Alta biomasa, tiempos cortos y bajo costo.
• Escherichia coli es la bacteria Gram negativa mas estudiada,
existiendo cepas que son completamente inocuas para el ser
humano.
• La combinación de plásmidos y Escherichia coli es la
alternativa massimple y empleada en clonado molecular
como sistema de plataforma para la construcción de
secuencias quiméricas de interés.

Plásmidos: Historia de su aplicación en clonado
1974

1977

1982

1985

pMB1

pBR322

pUC18

pUC118

1988

pBlueScript

1992

pZero

Plásmidos: Historia de su aplicación en clonado
1974

pMB1

Deriva de un aislamiento clínico.
Posee múltiples resistencias a AB y un ori...