4 ENZIMAS

1. Solución a los problemas sobre purificación de proteínas.
Esta sección contiene 7 problemas.
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1.- a) Para Separar las proteínas por medio de electroforesis es necesario usar un soporte que permita que las moléculas separadas no se mezclen nuevamente y puedan identificarse mediante alguna técnina de revelado, como puede ser latinción con azul ce Coomasie. Para ello se emplean soportes como la Agarosa y la Acrilamida/bisacrilamida. En el caso de las porteínas, el soporte mas conveniente es este último. La malla del gel permite que las moléculas al avanzar, empujadas en el campo eléctrico, gracias a su carga eléctrica, sean "frenadas" en función de su tamaño y forma. De modo que la electroforesis en gel permite separarmoléculas mediante un acombinación de su carga y de su masa.
Ahora, debido a que queremos separar las subunidades, debemos debilitar las interacciones covalentes y no covalentes que las mantienen unidas, tales como los punetes de disulfuro, las interacciones hidrofóbicas, los puentes de hidrógenos, las interaciones iónicas y las llamadas fuerzas de Van der Walls. Para ello basta con agragar un detergente,que reemplaza las interacciones hidrofóbicas proteína-proteína, por interacciones detergente-proteína, al hacer esto, expone al solvente gran parte del interior de la proteína y esto permite que se formen puentes de hidrógeno con el agua y que se solvaten los grupos cargados. Para romper los puentes de disulfuro que pudiesen existir, es necesario reducir estos enlaces para formar dossulfhidrilos. Los compuestos tales como el 2-mercaptoetanol (2ME), el 2,3-dimercaptopropanol (BAL), el dithioeritritol (DTE), el dithitreitol (DTT), y el Tris (2-carboxietil) fosfito (TCEP), son reductores que pueden emplearse bajo diferentes condiciones, siendo el primero el más débil (se emplea en caliente) y el último el más fuerte. En estas condiciones, la carga negativa del SDS hace casi uniforme larelación carga/masa de las proteínas, de modo que la separación depende casi enteramente del tamaño y la forma.
En resumen, necesitamos Acrfialmida/biscarilamida, Azul de Coomasie, 2-mercaptoetanol y SDS.
b) Para partir una cadena polipeptídica en fragmentos pueden emplearse métodos químicos o métodos enzimáticos, que pueden romper enlaces peptídicos en los que participan aminoácidos específicos.Entre los primeros está el Bromuo de cianógeno (CNBr) y entre los segundos se encuentras las endoproteinasas como la quimotrispsina.
c) Si desaemos digerir una cadena hasta aminoácidos para luego determinar la composición de la misma, podemos emplear HCL 6N @ 90 oC, lo que a lo largo de varias horas (24-72h) resultará en una ruptura completa de los enlaces peptídicos que forman el péptido. Losaminoácidos pueden analizarse separandolos mediante cromatografía de fase reversa (HPLC), cromatografía de intercambio iónico ó cromatografía de capa fina. Los picos de aminoácidos pueden detectarse mecdiante su reacción con el reactivo de ninhidrina. Para evitar que los grupos SH se oxiden a disulfuros, y dificulten la digestión, se emplea ácido perfórmico para oxidarlos a ácido cisteico o iodoacetamina,para formar el derivado S-alquílico correspondiente.
d) Finalmente, si lo que se desea es determinar la secuencia de aminoácidos de la proteína, debe emplearse un método que permita digerir uno a uno los amináciods. Esto puede hacerse mediante la degradación de EDMAN, que emplea el fenilisotiocianato y determina las feniltiohidantoinas de los aminoácidos en el extremo aminoterminal, como élpéptido digerido es ahora un aminoácido más corto, al repetirse el proceso se determina el segundo aminoácido y así sucesivamente.
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2.- En la electroforesis desnaturalizante, el logaritmo del peso molecular observa una relación aproximadamente lineal (negativa) con la mobilidad relativa. Haciendouna...