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Páginas: 6 (1460 palabras)
Publicado: 12 de octubre de 2015
UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
(Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA)
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
CÁTEDRA DE ANÁLISIS CLÍNICOS II
SEMINARIO: FUNDAMENTO Y
PROCEDIMIENTO DE LAS PRUEBAS DE
WESTERN BLOT
§
§
§
§
§
INTEGRANTES:
Calixto Flores David
Quispe Ollero, Elías
Oyola Salcedo, Delia
Espinoza Minaya,
María
Román Solano, Andrea
INTRODUCCI
ÓN
EXPOSITOR: VICTOR
WESTERNBLOT
El Western blot, o
inmunoblot, es una
técnica analítica usada
para
detectar
proteínas
específicas
en
una
muestra
determinada. Mediante
una electroforesis en
gel se separan las
proteínas.
Las
proteínas
son
transferidas desde el
Western BlotMETODos
Secuencia del Western
blot
Electroforesis de la muestra con las proteinas
Transferir las proteinas desde el gel a membrana denitrocelulosa
Coloracion de las proteinas para confirmar transferencia
Bloqueo de los sitios de union inespecificos remanentes en
la membrana de nitrocelulosa
Incubacion con el anticuerpo especifico primario
Lavados del anticuerpo no unido
Deteccion del anticuerpo unido utilizando anticuerpos
conjugados a perroxidasa de rabano picante (HRP)
Secuencia del Western blot – Paso 1
Paso 1
Electroforesis de lasmuestras de
proteínas:
-Las proteínas se desnaturalizan con calor, SDS y
sustancias como beta mercaptoetanol o ditiotreitol que
rompen puentes -S-SFuente de poder
-El SDS aporta cargas negativas
Muestra de proteínas
-Las proteínas
corren hacia el ánodo (+) y se distribuyen
para cargar en el gel
en el gel de acuerdo a su peso molecular
Proteínas ya corriendo
en el gel
Transferencia de lasproteinas a las membranas
Ciertas membranas sintéticas son capaces de unir
proteínas de tal forma que pueden servir como soporte
para inmunoensayos, tinciones y otros análisis en fase
sólida. Las proteínas unidas a dichas membranas
mantienen su antigenicidad y son accesibles a sondas.
En primer lugar las proteínas han de separarse en un gel
de acrilamida (1D o 2D PAGE), y antes de teñir el gel,dichas proteínas son electrotransferidas desde el gel hasta
una membrana adyacente de nitrocelulosa o PVDF,
aplicando un campo eléctrico.
La transferencia se puede llevar a cabo en dos tipos de
aparatos y por tanto de dos formas diferentes:
transferencia húmeda, en aparatos que poseen cámaras
que se llenan de tampón y transferencia semiseca, en
aparatos que no tienen dichas cámaras y por tantono
necesitan tal cantidad de tampón.
Transferencia de las
proteinas a las membranas
Secuencia del Western blot
Transferencia a la membrana de nitrocelulosa: Paso- 2
-Las proteínas separadas por tamaño se transfieren desde el gel a una membrana de
nitrocelulosa
-Otra vez se aprovecha la carga negativa de las proteínas
Se detiene la corrida electroforetica
Se quitan las burbujas paraasegurar
la correcta transferencia
Se desarma con cuidado la cuba electroforetica para liberar
el gel con las proteinas separadas por masa
Armado del cassette de transferencia
El gel con las proteínas se coloca en el cassette de transferencia
Cassette listo para iniciar transferencia
Paso 3
Incubación con anticuerpos específicos y revelado:
Proteína sobre la membrana
Bloqueo de los sitios noocupados
en la membrana con proteína inerte
(ej. Albúmina)
Incubar con anticuerpo
primario
Incubar con anticuerpo
secundario marcado con HRP
Incubar con sustrato especifico
Revelado
quimioluminiscente
Proteína de interes se ve como una
banda oscura
Paso 4
Revelado y análisis:
Existen otras tecnicas de revelado de WB
sustrato
enzima
H2O2
producto
coloreado
quimioLum
Obs
luminol
HRP
si
nosi
muy sensible
3,3´diaminobencidina
HRP
si
marrón
no
toxico
DAB+niquel
HRP
si
negro
no
toxico, mas
sensible que
DAB
3,3´,5, 5´
tetrametilbencidina
HRP
si
azul
no
producto
semisoluble
4 cloro naftol
HRP
si
azul-negro
no
poco
sensible
Bromocloroindolil
fostato +NBT
FAL
no
azul
no
reaccion
lenta y
progresiva
Naftol-AS-MX fosfato
+ Fast red
FAL
no
rojo
no
poco...
(Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA)
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
CÁTEDRA DE ANÁLISIS CLÍNICOS II
SEMINARIO: FUNDAMENTO Y
PROCEDIMIENTO DE LAS PRUEBAS DE
WESTERN BLOT
§
§
§
§
§
INTEGRANTES:
Calixto Flores David
Quispe Ollero, Elías
Oyola Salcedo, Delia
Espinoza Minaya,
María
Román Solano, Andrea
INTRODUCCI
ÓN
EXPOSITOR: VICTOR
WESTERNBLOT
El Western blot, o
inmunoblot, es una
técnica analítica usada
para
detectar
proteínas
específicas
en
una
muestra
determinada. Mediante
una electroforesis en
gel se separan las
proteínas.
Las
proteínas
son
transferidas desde el
Western BlotMETODos
Secuencia del Western
blot
Electroforesis de la muestra con las proteinas
Transferir las proteinas desde el gel a membrana denitrocelulosa
Coloracion de las proteinas para confirmar transferencia
Bloqueo de los sitios de union inespecificos remanentes en
la membrana de nitrocelulosa
Incubacion con el anticuerpo especifico primario
Lavados del anticuerpo no unido
Deteccion del anticuerpo unido utilizando anticuerpos
conjugados a perroxidasa de rabano picante (HRP)
Secuencia del Western blot – Paso 1
Paso 1
Electroforesis de lasmuestras de
proteínas:
-Las proteínas se desnaturalizan con calor, SDS y
sustancias como beta mercaptoetanol o ditiotreitol que
rompen puentes -S-SFuente de poder
-El SDS aporta cargas negativas
Muestra de proteínas
-Las proteínas
corren hacia el ánodo (+) y se distribuyen
para cargar en el gel
en el gel de acuerdo a su peso molecular
Proteínas ya corriendo
en el gel
Transferencia de lasproteinas a las membranas
Ciertas membranas sintéticas son capaces de unir
proteínas de tal forma que pueden servir como soporte
para inmunoensayos, tinciones y otros análisis en fase
sólida. Las proteínas unidas a dichas membranas
mantienen su antigenicidad y son accesibles a sondas.
En primer lugar las proteínas han de separarse en un gel
de acrilamida (1D o 2D PAGE), y antes de teñir el gel,dichas proteínas son electrotransferidas desde el gel hasta
una membrana adyacente de nitrocelulosa o PVDF,
aplicando un campo eléctrico.
La transferencia se puede llevar a cabo en dos tipos de
aparatos y por tanto de dos formas diferentes:
transferencia húmeda, en aparatos que poseen cámaras
que se llenan de tampón y transferencia semiseca, en
aparatos que no tienen dichas cámaras y por tantono
necesitan tal cantidad de tampón.
Transferencia de las
proteinas a las membranas
Secuencia del Western blot
Transferencia a la membrana de nitrocelulosa: Paso- 2
-Las proteínas separadas por tamaño se transfieren desde el gel a una membrana de
nitrocelulosa
-Otra vez se aprovecha la carga negativa de las proteínas
Se detiene la corrida electroforetica
Se quitan las burbujas paraasegurar
la correcta transferencia
Se desarma con cuidado la cuba electroforetica para liberar
el gel con las proteinas separadas por masa
Armado del cassette de transferencia
El gel con las proteínas se coloca en el cassette de transferencia
Cassette listo para iniciar transferencia
Paso 3
Incubación con anticuerpos específicos y revelado:
Proteína sobre la membrana
Bloqueo de los sitios noocupados
en la membrana con proteína inerte
(ej. Albúmina)
Incubar con anticuerpo
primario
Incubar con anticuerpo
secundario marcado con HRP
Incubar con sustrato especifico
Revelado
quimioluminiscente
Proteína de interes se ve como una
banda oscura
Paso 4
Revelado y análisis:
Existen otras tecnicas de revelado de WB
sustrato
enzima
H2O2
producto
coloreado
quimioLum
Obs
luminol
HRP
si
nosi
muy sensible
3,3´diaminobencidina
HRP
si
marrón
no
toxico
DAB+niquel
HRP
si
negro
no
toxico, mas
sensible que
DAB
3,3´,5, 5´
tetrametilbencidina
HRP
si
azul
no
producto
semisoluble
4 cloro naftol
HRP
si
azul-negro
no
poco
sensible
Bromocloroindolil
fostato +NBT
FAL
no
azul
no
reaccion
lenta y
progresiva
Naftol-AS-MX fosfato
+ Fast red
FAL
no
rojo
no
poco...
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