6-Fosfogluconato deshidrogenasa de pronormoblast

Pontificia Universidad Católica De Valparaíso
Facultada de Ciencias
Instituto de Química
Bioquímica

EXAMEN (Tema nº 11)
Purifique y Caracterice la
6-fosfogluconato deshidrogenasa de pronormoblasto.

Nombres: Esteban Palacios C.
Profesor: Dr. Christian Mandiola Q.
Curso: BQA 445-1
Fecha: 6/12/2010Desarrollo.

Obtención de células eritopoyéticas, en diferentes estados de maduración, desde bazos fetales murinos.
1.  Se debe Sacrificar una rata (dislocación cervical) con 14 días de gestación, para luego comenzar limpiando la piel de la zona abdominal con 70% de alcohol isopropílico con el fin de hacer una incisión de aproximado de 1 cm con una tijera estéril pararetirar la piel, evitando cortar la membrana peritoneal.

2.- Con una tijera estéril se realiza una incisión abdominal a través de la membrana abdominal con el fin de retirar el útero intacto, conteniendo en él los fetos.  Cada feto se debe colocar en un tubo con 50 ml de tampón PBS, para
eliminar sangre materna, restos de saco vitelino y placenta.
3.- Para obtener células individuales ensuspensión se deben extraer bazos desde 4 fetos usando un bisturí quirúrgico, luego estos son llevados a trituración mecánica usando tijeras finas estériles. El tejido resultante se pasa a través de una malla de acero inoxidable y luego se filtra usando una malla Nitex de 35 µm. Las células se recolectan en solución PBS (15 % suero bovino fetal (SBF)). Se debe centrifugación a 1500 rpm por 10 min a4ºC (recolección del precipitado en tampón PBS).

Separación de pronormoblasto usando gradiente de BSA.
Solución stock de BSA (Densidad 1.1 g/ml)
Se preparan soluciones de BSA con densidades de 1.085, 1.077 y 1.056 (g/ml) añadiendo a la solución madre de BSA tampón PBS necesario para lograr las densidades deseadas, debiéndose comprobar éstas con el densitómetro tanto inicialmente como almomento utilizarla. Se deben mantener los tubos eppendorf (2ml) con las diferentes densidades a 4ºC. Se pipetean 2 ml de la BSA 1.085 (g/ml) y se deposita en un tubo falcón de 15 ml. Paralelamente se pipetean 2 ml de la solución de BSA 1.077 (g/ml) sobre el mismo tubo falcón, lentamente y con la precaución de hacer gotear la solución por las paredes del tubo. Tras ello se hace lo mismo con lasolución de BSA 1.056 (g/ml).
Se habrá formado los gradientes discontinuos de densidad y esperando una separación clara entre cada una de las fases (cargando 6 ml de suspensión celular). Se tapa el tubo falcón de 15 ml con papel parafilm y se procede a su centrifugación a 2.200 rpm por 20 minutos a 4ºC.
Pasado este tiempo se retiran del tubos con pipeta Pasteur de plástico el material celular dela interfase 1.087-1.077 (g/ml) que correspondería a células pronormoblastos.

Fig 1.- Separación de células con diferentes estados de maduración obtenidas usando gradiente de BSA ( I y II interfase 1.087-1.077 (g/ml)) .

Cultivo celular de protonomoblasto placa Petri.
Se toman un volumen de la fracción anterior que contenga 2x106 células por ml (previo conteo celular) que luego seresuspende con 500µl de una solución que contiene 15% de FCS, 100 U / mI de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina, demás se incorpora 10µl de erythropoyetina 0,2 U / mI.  El cultivo se mantiene a 80% de humedad relativa, 5% de CO2 y 95% de aire a 37ºC durante 18 horas. 
Se realiza conteo de células antes y después del cultivo usando tinción Wright-Giemsa en cámara de Neubauer.

Extracción de 6fosogluconato deshidrogensa en cultivo de Pronormoblasto.
Las celular adheridas al cultivo se someterán a una tripsinisación (tripsina 0,5% p/v y EDTA 0,2% p/v) para desprenderlas, realizándose posteriormente un conteo de viabilidad (azul de tripan). Las células se lavarán 2 veces con PBS en hielo, para luego centrifugarse por 10 minutos a 250 g 4ºC. El pellet obtenido se re-suspenderá en un...