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UNIVERSIDAD
 DE
 ANTIOQUIA
 
ESCUELA
 DE
 MICROBIOLOGÍA
 
MICROBIOLOGÍA
 INDUSTRIAL
 Y
 AMBIENTAL
 

 

 

 
INGENIERÍA
 GENÉTICA
 
MANUAL
 DE
 PRÁCTICAS
 

 

 

 
Elaborado
 por:
 
Laura
 Margarita
 Castañeda
 Sandoval
 
Lina
 María
 López
 de
 Ávila
 

 

 

 

 
MEDELLÍN,
 2015
 

ESCUELA
 DE
 MICROBIOLOGÍA –
 MICROBIOLOGÍA
 INDUSTRIAL
 Y
 AMBIENTAL
 
Manual
 de
 prácticas
 Ingeniería
 Genética
 

 


 
PRÁCTICA
 6.
 PREPARACIÓN
 DE
 UN
 PLÁSMIDO
 RECOMBINANTE
 
1. INTRODUCCIÓN
 
Los
  plásmidos
  son
  moléculas
  de
  ADN
  circular,
  de
  doble
  cadena,
  autorreplicativas
  y
 
extracromósomicas
  que
  se
  han
 encontrado
  en
  una
  amplia
  variedad
  de
  especies
 
bacterianas.
 El
 tamaño
 de
 los
 plásmidos
 puede
 variar
 en
 tamaño
 desde
 1
 kb
 hasta
 200
 kb.
 
Los
  plásmidos
  presentan
  generalmente
  un
  rango
  de
  hospederos
  estrecho
  y
  pueden
  ser
 
mantenidos
  solo
  en
  un
  grupo
  limitado
  de  especies
  relacionadas;
  se
  comportan
  como
 
unidades
  genéticas
  accesorias
  que
  se
  replican
  y
  son
  heredadas
  independientemente
  del
 
cromosoma
 bacteriano.
 
 
Los
  plásmidos
  empleados
  en
  ingeniería
  genética
  contienen
  un
  sitio
 múltiple
 de
 clonación
 
o
 polylinker,
 el
 cual presenta
 las
 secuencias
 de
 reconocimiento
 para
 una
 amplia
 variedad
 
de
  enzimas
  de
  restricción.
  Las
  secuencias
  que
  flanquean
  el
  polylinker
  son
  útiles
  para
  la
 
manipulación
  o
  análisis
  del
  ADN
  insertado.
  Generalmente
  el
  sitio
  múltiple
  de
  clonación
  se
 
encuentra
 al interior
 del
 gen
 de
 la
 β-­‐
 galactosidasa,
 lo
 anterior
 para
 fines
 de
 selección
 de
 
transformantes
  y
  recombinantes.
 
  Además,
  éstos
  plásmidos
  presentan
  un
  origen
  de
 
replicación
  (ORI)
  del
  plásmido
  ColE1,
  para
  conseguir
  un
  número
  de
  copias
  elevado
  del
 
plásmido,
 y
 otro origen
 de
 replicación
 derivado
 de
 un
 fago
 con
 DNA
 monocatenario
 (M13,
 
f1),
 que
 permite
 producir
 fagos
 filamentosos
 con
 copias
 monocatenarias
 del
 DNA
 clonado,
 
útiles
 para
 secuenciación,
 mutagénesis,
 etc.
 Los
 plásmidos
 también
 presentan
 marcadores
 
de
 selección,
 los
 cuales
 son genes
 que
 codifican
 para
 enzimas
 que
 confieren
 resistencia
 a
 
antibióticos
 como
 ampicilina,
 kanamicina,
 tetraciclina,
 cloranfenicol
 y/o
 eritromicina.
 Los
 
plásmidos
  utilizados
  para
  realizar
  expresión
  de
  proteínas
  presentan
  además
  promotores
 
de
  fagos
  (T7,
  SP6)
  previos
  al
  sitio
 múltiple
  de
  clonación,
  útiles
  para
  la
 
transcripción/traducción
 in
 vitro
 del
 DNA
 clonado,
 o
 para
 su
 expresión
 regulada
 in
 vivo
 si
 
el
 plásmido
 recombinante
 se
 introduce
 en
 bacterias
 que
 expresan
 la
 RNA
 polimerasa
 viral.
 

 

 

 

2
 

ESCUELA
 DE
 MICROBIOLOGÍA
 –
 MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
 Y
 AMBIENTAL
 
Manual
 de
 prácticas
 Ingeniería
 Genética
 

 

De
  acuerdo
  a
  las
  características
  de
  los
  plásmidos
  estos
  pueden
  utilizarse
  como
 
vectores
  de
  clonación,
  preservación,
  inserción
  o
  sobreexpresión.
  Los
  plásmidos
  usados
 
como
  vectores
  eran
  de
  origen
 ...