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Urea
Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos moléculas de amoniaco por acción del enzima ureasa. Esta actividad enzimática es característica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para diferenciar este género de otras enterobacterias que dan negativo o positivo retardado.
Se cultiva el microorganismo en slant en agar urea de Christensen. Este mediose complementa después del autoclavado con 50ml/l de urea. Ésta será degradada por aquellos microorganismos capaces de producir el enzima ureasa. Esta degradación produce amoniaco que hará variar el color del indicador de amarillo a rojo, poniéndose así de manifiesto la actividad ureasa.
Para revelar el resultado de esta prueba es importante tener en cuenta el tiempo de incubación ya queespecies de Proteus vuelven alcalino el medio poco después de la inoculación y sus resultados deben ser leídos en las primeras 2-6 horas, mientras que Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae tienen actividad ureasa dentro de las 24-48 horas de incubación.

Oxidasa
Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistemacitocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo que es reducido por el oxígeno molecular que produce agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana. El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general, el sistema citocromooxidasa sólo se encuentra en los organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y,excepcionalmente, en algún microaerófilo (Vibrio fetus), pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa. Asímismo, la presencia de oxidasa va ligada a la producción de catalasa, ya que ésta degrada el peróxido de hidrógeno (ver prueba de la catalasa) que se produce como consecuencia de la reducción del oxígeno y cuya acumulación es tóxica.
La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para
*Identificar todas las especies de Neisseria (+)
* Diferenciar Pseudomonas de los miembros oxidasa negativos de las enterobacterias.
El reactivo de la oxidasa más recomendado es la solución acuosa al 1% de diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (reactivo de Kovacs). Es menos tóxico y mucho más sensible que el correspondiente compuesto dimetilo (reactivo de Gordon y McLeod), pero es máscaro. Este reactivo tiñe las colonias oxidasa positivas de color lavanda que vira gradualmente a púrpura-negruzco intenso.
Realización de la prueba:
1. Método en placa directa
* Agregar directamente 2-3 gotas de reactivo a algunas colonias. No inundar toda la placa y no invertirla.
* Observar los cambios de color. Con el reactivo de Kovacs la reacción se produce en unos 10-15segundos, mientras que con el de Gordon y McLeod es dentro de los 10-30 minutos.
1. Método indirecto sobre papel
* Colocar un trozo de papel de filtro de 3x3cm aproximadamente en una placa de Petri.
* Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel.
* Extender con el asa de siembra una colonia sobre el papel impregnado.
* La reacción de color positiva se producea los 5-10 segundos.

Indol
Mediante esta prueba se detecta la liberación de indol en un cultivo bacteriano. Dicha liberación se debe a la degradación del aminoácido triptófano mediante el enzima triptofanasa.
Para la realización de esta prueba la bacteria se cultiva durante 24-48 horas en un caldo de triptona con NaCl al 0,5% (la triptona presenta abundante triptófano). Para la posteriordetección del indol se usa el reactivo de Kovacs que se puede preparar con los siguientes ingredientes:
* Alcohol amílico o isoamílico (puede sustituirse por alc.butílico)........150ml
* p-dimetilamino-benzaldehído..........................................................10g
* HCl (concentrado).........................................................................50ml
Se disuelve...