ACTIVIDAD CATALÍTICA DE ENZIMAS

MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD CATALÍTICA DE ENZIMAS Y/O DE EXTRACTOS CRUDOS ENZIMÁTICOS: AMILASAS.
INTRODUCCIÓN
En la reacción enzimática, la enzima no es consumida ni modifica, de manera queteóricamente debe poder seguir catalizando reacciones, por lo tanto si se garantiza que la concentración de sustrato no será un elemento limitante, a mayor tiempo de reacción mayor será la formación de productoy la degradación del sustrato.
Esta actividad enzimática se mide en unidad de actividad enzimática (U) lo que se refiere a la cantidad de enzima que en una reacción enzimática cataliza la conversiónde 1 µmol de sustrato por minuto.
La actividad enzimática específica se utiliza en combinación con otras unidades (U/mg de proteína o U/mL) para señalar, respectivamente, la actividad enzimáticaespecífica o la concentración de actividad enzimática.
OBJETIVOS
Determinar la actividad enzimática de la α-amilasa y calcular las unidades de actividad enzimática.
MATERIALES Y MÉTODOS
A partir deuna solución de α-amilasa con una concentración de 5 mg/mL se determinó la cantidad de proteína por el método de Bradford y UV y la actividad enzimática.
Para la determinación de proteínas con elmétodo de Bradford se hizo dilución 1:10 de la solución de amilasa (5 mg/mL) por duplicado se tomaron 0.25 mL, se adicionó 0.75 mL de la solución de Bradford, se esperó 5 minutos y se leyó a 595 nm. Sedeterminó la concentración de proteína con la curva tipo de la práctica 1.6, posteriormente se leyeron las muestras en el espectrofotómetro a 595 nm.
El análisis UV fue hecho de la solución deα-amilasa sin diluir a 280nm utilizando como blanco una solución de fosfatos.
Cinética de hidrolisis de almidón: En cada tubo eppendorf de 1.5 mL se agregó .1 mL del reactivo DNS, por separado se agregó a uneppendorf .95 mL de la solución de almidón al 1% (previamente preparada) a 20°C. Se adicionó a cada tubos 0.05mL de la solución de amilasas, con un intervalo entre cada tubo de 30 segundos. Para...