Actividad de beta-galactocidasa

UNIVERSIDAD POLITECNICA DEL ESTADO DE MORELOS
ENSAYO ENZIMÁTICO DE β-GALACTOSIDASA

BIOQUIMICA MICROBIANA

CATEDRATICO.: MANUEL JESUS GRANADOS BAEZA

ALUMNOS: ARAGON AROCHE CYNTHIA CARDENASSOLANO JUAN JOSE HERRERA MENDEZ LUCIA SEQUERA GRAPPIN IVAN SANTIBAÑEZ GARCIA GUADALUPE ANISLADA

ING. BIOTECNOLOGIA GRUPO: “A” CUATRIMESTRE: 4°

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ENSAYO ENZIMÁTICO DE β-GALACTOSIDASA
La-galactosidasa (EC 3.2.1.23) es una enzima capaz de hidrolizar -Dgalactósidos. Esta enzima hidroliza la lactosa en sus monómeros glucosa y galactosa, al escindir el enlace β 1-4 del azúcar. Para conocer laactividad que esta enzima realiza de manera práctica tomando en cuenta las propiedades que esta presenta se utiliza un sustrato cromogénico artificial orto-nitrofenil--D-galactopiranósido (ONPG) elcual sustituye como sustrato a la lactosa. Cuando la -galactosidasa se une a ONPG, ortonitrofenol se libera. ONPG es incoloro, mientras que el compuesto resultante (ONP) de la actividad de esta enzima(hidrólisis) presenta un color amarillo en la solución la cual absorbe la luz ( max = 420 nm). Por lo tanto, la actividad enzimática puede ser medida por la tasa de aparición de color amarillo conayuda de un espectrofotómetro.

Figura 1. Hidrólisis de sustrato orto-nitrofenil--D-galactopiranósido por acción de la enzima β-galactosidasa. El sustrato utilizado se fragmenta en dos compuestos:ortonitrofenol y galactosa, el primero genera una coloración amarilla en la solución. Reactivos requerido: Una unidad de enzima causa hidrólisis de un micro mol de o-nitrofenil-β-Dgalactopiranósido porminuto a 25 ° C y un pH de 7.5. Reactivos:  buffer fosfato de sodio 0.3 M  pH 7.5 con cloruro de magnesio 0.003 M Diluyente de sustrato:  Tris 0.01 M  Acetato  pH 7.5 con cloruro de magnesio0.01M

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Diluyente para enzima:  Tris 0.01 M  HCl  pH 7.5 con cloruro de magnesio 0.01 M  Mercaptoetanol 0,01 M  cloruro sódico 0.01 M  Sodio 0.10 M / buffer fosfato de potasio  pH 7.0 ...