ACTIVIDAD DE LA AMILASA

ACTIVIDAD DE LA AMILASA SOBRE EL ALMIDÓN

OBJETIVO: Verificar la actividad de la amilasa sobre el almidón a través de su producto de hidrólisis.
Resumen
La ?-amilasa es una enzima proteica que se encuentra en la saliva humana y cataliza la degradación del almidón, que es un polisacárido de reserva vegetal. El almidón está formado por dos tipos de moléculas: la amilosa y la amilopectina, ambospolisacáridos de glucosa. La amilosa se conforma por cadenas lineales de glucosas unidas por enlaces ?- C1-C4, mientras que la amilopectina tiene, además de estos últimos enlaces, uniones C1 con C6, formando cadenas ramificadas. La ?-amilasa rompe uniones C1-C4, tanto en la amilasa como en la amilopectina, dejando dextrinas lineales y ramificadas (oligosacáridos) como productos.

Para medir laactividad enzimática de la ?-amilasa, se utilizará un test colorimétrico que detecta el almidón. Para ello se contará con una solución de iodo/ioduro de potasio (I2/IK), ya que el almidón en presencia de esta solución adquiere una coloración azulada característica. Esto tiene una explicación física: el iodo se coloca en el interior de la hélice que forma la amilosa (en las regiones hidrofóbicas),formando un complejo de color azul. Cuando la ?-amilasa actúa, degrada la amilosa, se desintegra la hélice y por tanto en presencia de I2/IK ya no dará una coloración azul.

Por lo tanto, en este TP mediremos la desaparición de sustrato (evidenciada por el test colorimétrico) para determinar la actividad de la enzima. Además, analizaremos cómo afectan las distintas condiciones en que actúa laenzima (pH, temperatura, concentración de NaCl), así como los efectos que pueden causar diferentes pretratamientos (proteinasa, calor).


INTRODUCCIÓN
El almidón es un polisacárido muy abundante en los vegetales en los cuales se encuentra generalmente en forma de pequeños gránulos microscópicos de estructura cristalina. El grano de almidón está formado por amilosa y amilopectina. Laamilopectina se encuentra en la parte exterior del grano, es insoluble en agua y no da coloración con la solución de lugol. La amilosa se encuentra en la parte interna y da coloración violeta en presencia del lugol.
Por otro lado, la amilasa cataliza la hidrólisis del almidón, glucógeno y dextrinas superiores en moléculas cada vez más pequeñas, en un proceso progresivo dando como producto final eldisacárido maltosa. La amilasa es una mezcla de enzimas. En el hombre la encontramos en la boca (amilasa salival) y en intestino (amilasa pancreática). La amilasa pancreática se considera idéntica en su acción a la amilasa salival. El ph óptimo para la amilasa salival es de 6.6. Cuando se encuentra en medios con ph más ácidos o más alcalinos, la actividad de la enzima disminuye o se inhibe porcompleto. La presencia de sales también modifica la actividad de esta enzima.
En esta práctica, el avance de la hidrólisis del almidón se demostrará siguiendo la formación del complejo con yodo el cual da una coloración violeta con los almidones. A medida que se va efectuando la hidrólisis, el color azul va desapareciendo y aparece un color rojizo (eritrodextrinas) y posteriormente se observa unacoloración amarilla, debida únicamente a la solución de yodo, lo que demuestra que el almidón ha sido hidrolizado hasta maltosa.
Dextrinas solubles Acrotextrinas
almidón
Almidón soluble
+
+
Maltosa
Molec. maltosa Molec. Maltosa
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales

• 7 tubos de ensayo
• Baño María
• Placa de porcelana excavada
• Gradilla
• Tres pipetas de 1 ml
• Dos pipetas de 5ml
• Dos pipetas de 10 ,l
• Tres pipetas Pasteur
• Pinzas para tubos
• Almidón 1% en regulador de fosfatos 0.02 M
• Glucógeno 1% en regulador de fosfatos 0.02 M
• Regulador de fosfatos 0.02 M
• Solución de NaCl 0.5 N
• Solución de amilasa pancreática al 1% o amilasa salival
• Solución de lugol.

Metodología
• Prepare una serie de 7 tubos de ensayo debidamente etiquetados de...