Actividad de la glutamato deshidrogenasa

LA ACTIVIDAD DE LA GLUTAMATO DESHIDROGENASA PUEDE SER TRANSMITIDA NATURALMENTE A CEPAS DE Lactococcus lactis PARA ESTIMULAR LA CONVERSIÓN DE AMINOÁCIDOS A COMPUESTOS AROMATICOS.
Instituto Nacional de Investigación Agronómica, Unidad de Bioquímica y estructura de las proteínas, Francia, 2005. Autores: Catherine Tanous, Emilie Chambellon, Dominique Le Bars, Gilbert Delespaul y Mireille Yvon
Introducción:
Glutamato deshidrogenasa
Es una enzima hexamerica, de alto peso molecular y dependiente del NAD(P) la cual se localiza en la matriz mitocondrial.
Cataliza la siguiente reacción:

La bacteria de importancia en este artículo es Lactococcus lactis la cual tiene las siguientes características:
• Se agrupa como un diplococo y en cadenas cortas
• Bacteria no esporulante
• Gram +
•Produce grandes cantidades de ácido láctico

Este tipo de bacteria se puede utilizar para industria de lácteos, en este artículo específicamente en la utilización que tiene en la producción de quesos, para proporcionar olor y sabor, algunos ejemplos de estos quesos son:
• Queso Camembert
• Queso Cheddar
• Queso Colby
• Queso Gruyere
• Queso Parmesano
• Queso Roquefort
La conversiónde aminoácidos a compuestos aromáticos por Lactococcus lactis está limitada por la baja producción de α-cetoglutarato que es necesario para el primer paso de la reacción. Recientemente, la actividad de la glutamato deshidrogenasa (GDH), cataliza la desaminación reversible del glutamato a α-cetoglutarato se detectó en las cepas de L. lactis, aisladas de una fuente vegetal, y el gen responsable de laactividad de L. lactis NCDO1867 fue identificado y caracterizado. El gen se encuentra en un plásmido de 70-kb, el cual también codifica la resistencia al cadmio. En este estudio, la inactivación y la sobreexpresión de genes gdh confirmó el impacto directo de la actividad GDH de L. lactis sobre el catabolismo de aminoácidos en un medio de reacción a un pH de 5.5, el pH del queso. Mediante el usode la resistencia a cadmio como un marcador genético, el plásmido se transmitió naturalmente a otra cepa de L. lactis mediante un procedimiento de apareamiento. La transferencia fue atribuida a la actividad de la GDH de la cepa acogida y la capacidad de catabolizar aminoácidos en presencia de glutamato en el medio de reacción. Sin embargo, el plásmido parecía inestable en una cepa que tambiéncontiene el plásmido lactosa proteasa pLP712, lo que indica una incompatibilidad entre estos dos plásmidos.
En este estudio se utilizó al aminoácido fenilalanina el cual tiene la siguiente ruta catabólica con la cual podemos utilizar como parámetro para saber la actividad de la enzima para la producción de estos compuestos derivados del aminoácido.

En los métodos que se llevaron a cabo seutilizaron varias cepas de las cuales las que más destacan son las siguientes por los plásmidos que poseen los genes de importancia.
Cepa Características
L. lactis subsp. lactis NCDO1867a Contiene pGdh442 (GDH+ Cdr)
TIL487 NCDO1867 contiene pGhost9 insertado en gdh (GDH- Eryr)
TIL506 TIL504 conteniendo pLP712 (GDH+)
TIL488 TIL46 conteniendo gen gdh en pMSP3545 (GDH+ Eryr)

El medio que seutilizo para el crecimiento de las cepas fue el medio M17 el cual está compuesto por:
• Agua
• Β-glicerol fosfato
• Extracto de carne
• Ácido ascórbico
• Peptona
• Agar
• MgSO4•7H2O
• Extracto de levadura
**Al medio se le adiciono glucosa (M17-G) o lactosa (M17-L)
Condiciones de cultivo
Las cepas de Lactococcus lactis se cultivaron en ambos medios M17-G y M17-L y se incubaron a unatemperatura de 30°C.
La cepa TIL487 es una cepa que no contiene en su plásmido la actividad GDH (GDH-) y es Eryr (lo que nos ayuda como un marcador), también es termosensible por esa razón se cultiva a diferente temperatura.
Para los experimentos de sobreexpresión se utilizo la cepa TIL488, la cual contienen en su plásmido actividad GDH (GDH+) y es Eryr, esta cepa se cultivo ene medio M17-L, esta...