Actividad enzimática

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA PIRUVICO TRANSAMINASA

INTRODUCCIÓN
Cinética enzimática
Las enzimas son proteínas que realizan la catálisis de las reacciones químicas que se llevan a cabo en los seres vivos. Aunque las reacciones enzimáticas obedecen a los mismos principios de la cinética química, se diferencian de éstas por el hecho de que las enzimas son saturadas por los substratos.
Duranteuna reacción enzimática, el substrato S se une químicamente a la enzima E para formar un complejo "enzima-substrato" (ES). Luego de sufrir varias reacciones químicas, el complejo ES se rompe para dar origen al producto P, liberando a la enzima E, que puede volver a iniciar otro ciclo catalítico.

E + S \=====\ ES \=====\ E + P

Se supone que estas reacciones son reversibles.
En 1913, Michaelisy Menten desarrollaron la teoría cinética general que explica el comportamiento de las reacciones enzimáticas.
Transaminasas
En el catabolismo de más de una docena de aminoácidos, el grupo alfa-amino es removido mediante catálisis enzimática. Ya que la reacción es una transaminación, las enzimas responsables son designadas como aminotransferasas o transaminasas. En esta reacción el grupoalfa-amino se transfiere al carbono alfa de un alfa-cetoácido, frecuentemente ácido alfa-cetoglutárico.
Algunos ejemplos de este tipo de enzimas son la aspartato aminotransferasa, la leucino transaminasa, la tirosina transaminasa y la alanina transaminasa que actúa en la catálisis de la reacción del presente experimento.

La actividad de la alanino transaminasa se determina por colorimetría midiendola cantidad del alfa-cetoácido producido (ácido pirúvico), mediante la reacción estequiométrica con 2,4 dinitrofenilhidrazina (2,4-DNPH), que forma un compuesto colorido que tiene una absorción máxima Amáx a una longitud de onda de 505 nm.

Objetivo general
Medir la actividad enzimática de la Alanina aminotransaminasa en un extracto crudo de semillas de chicharo mediante un métodoespectrofotométrico.
Objetivos particulares
Determinar parámetros cinéticos, tales como la Km y Vmax de la transaminasa extraída de chícharos frescos.

Material:
1 charola para hielo
1 Centrifuga clínica
1 Mortero con pistilo
1 Embudo de vidrio
6 tubos de centrifuga
15 tubos de ensayo
1 Gradilla para tubos
1 Pipeta graduada de 10 mL
1 Pipeta Pasteur
3 Pipetas de 1 mL graduadas en 1/100
3 Pipetasgraduadas de 5 mL
2 Pipetas graduadas de 10 mL
1 Vaso de precipitados de 600 mL
1 Mechero
1 Tripie con tela de asbesto

Material proporcionado por el ALUMNO (A):
Chicharros en vaina
Navaja filosa
Arena fina
Gasa

Reactivos.
✓ Solución patrón de piruvato (Acido piruvico 1 mM).
✓ Sustrato (Alanina/α-cetoglutarato 1 mM/ 1mM).
✓ Solución amortiguadora de Tris-HCl 0.1 M pH7.5 y EDTA 4%.
✓ Solución amortiguadora de Tris-HCl 40 mM pH 7.5 y EDTA 0.25 mM.
✓ Reactivo de Color (Solución de 2,4-dinitrofenilhidrazina al 0.01% en HCl 1.0 N).
✓ Solución de Hidróxido de sodio 0.4 N.

Procedimiento.
A. Procedimiento de obtención de la enzima:
1.-Poner el mortero en la charola con hielo (baño de hielo).
2.- Pesar 10 gramos de chícharos, picarlos con unanavaja sobre el mortero frío.
3.- A los trozos de chícharo, adicionar 20 mililitros de la solución amortiguadora de Tris-HCl 40 mM, una cucharadita de arena fina y macere hasta obtener una suspensión homogénea (manteniendo siempre el mortero en el baño de hielo).
4.- Filtrar la suspensión homogénea de chicharos a través de cuatro capas de gasa, y con ayuda de un embudo de vidrio recuperar elfiltrado en un tubo de centrífuga.
5.- Equilibrar los tubos de centrífuga, y centrifugar a 3 000 rpm por 5 minutos.
6.- Recuperar con una pipeta Pasteur la parte liquida (sobrenadante), teniendo cuidado de no tocar el “botón”. El sobrenadante colocarlo en un tubo de ensaye y etiquetarlo como “enzima”, mantener la enzima siempre en baño de hielo.

B. Efecto de la concentración de sustrato y curva...