Actividad a-amilasa en semillas de cebada

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Laboratorio fisiología celular BIO 135

PRÁCTICO 5
Actividad (-amilasa en semillas de cebada

Integrantes:
Juan José Almonte
Jonathan Celiz
Sebastián Bluck
Introducción:

El glicógeno y el almidón son fundamentales para la célula vegetal ya que de estos saldrá la glucosa necesaria para la glicólisis. Pueden  venirdirectamente de la fotosíntesis en el caso  de  las células  fotosintéticas o bien a partir del degradamiento de disacáridos y polisacáridos de reserva

Degradamiento hidrolítico:

En este paso aparecen enzimas amilasas que participan en este proceso, pertenecen a la categoría de las enzimas hidrolasas que provocan la hidrólisis en enlaces glicosídicos (glicosidasas). Existen dos tipos deamilasas: La ( - amilasa y la ( - amilasa. Ambas se diferencian en el modo de desdoblar las moléculas de almidón

( - amilasa: se encuentra ampliamente  distribuida  en  el reino  vegetal  y también en la saliva humana y en  el  páncreas. Está presente particularmente en las semillas con reservas de hidratos de carbono como el trigo, la cebada, etc., de donde ha sido posible aislarla en formapura. Su peso molecular es alrededor de 60.000. la ( - amilasa se secreta al endospermo amiláceo de las semillas de cereales por dos tejidos, el cotiledón y la capa de aleurona, degradando las macromoléculas de amilosa y amilopectina  de las cuales se compone en general el almidón primeramente en pequeños fragmentos de 6 a 7 unidades de glucosa (1).

( - amilasa: está presente sólo en  el  reinovegetal  y se ha aislado también a partir de semillas de  trigo  y cebada durante la germinación. La   ( - amilasa puede efectuar el degradamiento de la amilosa y la amilopectina solo a partir de los extremos no reductores  de estas moléculas. Cada dos unidades de glucosa  son separadas en forma de maltosa. La ( - amilasa es una "exoenzima" que tampoco  puede desdoblar los enlaces ( (1-6) de laamilopectina. Por esta razón las moléculas de amilopectina solo puede ser hidrolizada parcialmente conservando en un 40-45% sin hidrolizar (2)

Objetivos:

1- Presenciar la acción de la ( - amilasa en las semillas de cebada a través de un marcador molecular.
2- Estudiar y comparar la acción ( - amilasa en semillas y extracto.

Materiales y métodos:

• 2 placas petri(con gelalmidón 1% y agar 1%)
• 2 micropipetas( 20-50uL y 1000uL)
• Bisturí
• 2 tubos falcon
• Lugol 10%
• Semillas previamente tratadas
• Lugol 10%
• Buffer

Procedimiento

1.- En un comienzo se preparó la solución correcta de lugol (estaba al 40% y se necesitaba solución al 1’%). Luego se cortaron 6 semillas ya congeladas y tratadas por la mitad rápidamente para queno ganen calor. Se procedió a introducir cuidadosamente por el lado cortado en una de las placas con gel.

Se dejó reposar por 35 minutos y se procedió incorporar la solución de lugol 10%. Esta parte se realizó rápidamente y se lavo inmediatamente con agua. Por último se fotografió el resultado

2.- Las semillas ya tratadas previamente y homogeneizadas en buffer son centrifugadas a 8.000 rpmen una centrífuga refrigerada por 20 minutos. Se extrae el sobrenadante y se calienta a baño María a 70°C por 15 minutos. Luego se enfría en hielo. Una vez precipitadas las proteínas se centrifuga a 8.000 rpm por 5 minutos el sobrenadante. Se elimina el precipitado de la solución resultante y el sobrenadante se adiciona a las placas petri con gel en los pequeños orificios previamente hechos algel.
Por último se procedió a realizar los mismos pasos que en 1, es decir, una vez transcurrido el tiempo, se introduce rápidamente el lugol al gel y se lava inmediatamente con agua.

Resultados:

[pic]
a) Placa con gel (almidón 1% y agar 1%) y expresión de (-amilasa unida a semillas

Se observa claramente definida, al ser incolora, la pate del gel donde se encontraban las semillas, en...