ADN RECOMBINANTE

Tecnología del ADN recombinante o Ingeniería Genética

Conjunto de técnicas que permiten manipular y analizar el ADN

Aplicaciones de las técnicas del ADN recombinante
 Biotecnología:
- Producción de proteínas recombinantes para estudios de investigación básica
y/o para su aplicación en diversos campos (producción de hormonas, anticuerpos,
antivirales, vacunas, enzimas, polímeros)

- Obtenciónde organismos transgénicos (modificados genéticamente) con
propiedades útiles
- Aplicaciones en Medicina. Diagnóstico de enfermedades infecciosas y genéticas.
Terapia génica. Medicina forense.
 Ecología microbiana. Determinación de la biodiversidad (independiente de
cultivo). Estudio de la composición y función de comunidades microbianas
(Metagenómica)
 Evolución. Estudio de las relacionesfilogenéticas entre organismos
(comparación de secuencias de genes universalmente conservados. Ej. ARNr
16S y 18S)
 Genómica. Obtención y análisis de la sec. nt de genomas enteros.

Biotecnología: producción industrial de bienes y servicios por procesos que usan
organismos biológicos. Toma experiencia de la Microbiología, Bioquímica e
Ingeniería Química.
Biotecnología molecular (Biot. M):manipulación de genes con el propósito de
producir bienes y servicios útiles usando organismos vivos. Se basa en la aplicación
de la tecnología del ADN recombinante.

Beneficios de la Biot. M :
- Diagnóstico
- Producción de organismo con propiedades útiles (pantas y animales)
- Microorganismo productores de enzimas, antibióticos, polímeros.
- Biorremediación de ambientes contaminados

Las técnicas del ADNrecombinante permiten desplazarse experimentalmente
desde el gen a la proteína y desde la proteína al gen

Producción de proteínas recombinantes

Pasos:
 Clonar del gen codificante de la proteína según método más apropiado
 Determinar secuencia nt

 Subclonar el gen de interés en un vector de expresión
 Transformar un organismo huésped apropiado e inducir la expresión del
gen.
 Purificar laproteína y analizar sus propiedades biológicas

Cómo aislar un gen de un organismo?
Clonado de genes: Aislamiento y amplificación de un gen de interés para su
posterior manipulación genética
Pasos:
1. Aislamiento de la fuente de ADN: ADN genómico (fragmentación), ADNc o
amplificación del gen por PCR.

2. Inserción en vector
3. Introducción y amplificación en organismo huésped
4. Identificación delgen de interés (hibridación con sonda de ADN, inmunodetección,
análisis funcional, complementación)

Construcción de una genoteca a partir de
ADN genómico

)

Obtención de clones
genómicos o de ADNc por PCR

La técnica de PCR es útil para
clonar fragmentos de ADN
relativamente cortos (< 10 kbp)
cuando se conoce la secuencia
del gen.

Clonado de productos de PCR: «TOPO-cloning»
Los productos dePCR generados por la Taq ADN polimerasa contienen deoxi-adenosina
(A) simple cadena en extremo 3’ debido a su actividad transferasa terminal independiente de templado.
Estos se pueden ligar al vector TOPO, que contiene dT en sus extremos 5 ´, en forma directa usando la
reacción de la topoisomerasa.

Capacidad de diferentes vectores de clonado

Tipo de vector

Inserto (kbp)

Plásmido

20

Fagolambda

25

Cósmido

45

P1

100

BAC

300

YAC

1000

Expresión heteróloga de proteínas recombinantes
En bacterias E. coli

Ventajas:
- Fisiología y genética muy conocida
- Fácil manipulación en laboratorio
- Relativo bajo costo

Desventajas:
- No produce muchas de las
modificaciones post-traduccionales
requeridas para la expresión de
proteínas de eucariotas.
- La proteína puede resultar tóxica

-La proteína mal plegada puede
formar cuerpos de inclusión
insolubles.

Elementos típicos de un vector de expresión bacteriano
Deben tener:
-Un promotor fuerte (alto nivel
expresión del ARNm), generalmente
regulable (la proteína expresada
puede resultar tóxica para la
bacteria)
- Un terminador transcripcional
- Un sitio de unión al ribosoma
cercano al AUG iniciador

Vector de expresión en E....