Adn E. Coli
Páginas: 12 (2810 palabras)
Publicado: 4 de marzo de 2013
LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR Y BIOQUÍMICA I
Obtención de ADN de Escherichia coli
Resumen
En este laboratorio se realizo la extracción de ADN de Escherichia coli por el método de Marmur modificado. Para esto, se aplicó una lisis de células bacterianas usando una solución fresca de lisozima, que daña la membrana celular. Se continuo con la desproteinización y extracción del ADNagregando perclorato de sodio y cloroformo-alcohol isoamílico, el cual permite la extracción del ADN en una suspensión de dichas bacterias. Posteriormente se realizo una prueba cualitativa con difenilamina que indica la presencia de ADN dando un producto de color azul oscuro para la muestra patrón y azul claro para la muestra extraída, y dando negativo para el ARN y el blanco sin presentar cambiode color. Para la cuantificación del ADN extraído se realizó una curva de calibración (absorbancia Vs. concentración) por medio de espectrofotometría a una longitud de onda de 595 nm con el producto coloreado de la reacción de la difenilamina con ADN a diferentes concentraciones, donde se pudo calcular la concentración de ADN extraído de E. coli que fue de 0.25 mg/ml.
Palabras clavesEscherichia coli – Marmur – ADN – Difenilamina – Desprotenización
Introducción
Las bacterias constituyen un grupo heterogéneo de organismos desde el punto de vista morfológico. Las estructuras comunes en la mayoría de las bacterias son la pared celular, membrana plasmática y citoplasma en el cual se encuentra un ADN circular y numerosos ribosomas (Macarulla and Goñi, 1994). Escherichia coli esuna bacteria Gram-Negativa que se encuentra con mayor frecuencia en las heces de los mamíferos. Su nicho ecológico es el intestino grueso y delgado, hace parte de la flora nativa intestinal sin causar ningún daño, por el contrario, producen sustancias que son útiles al hospedero como las Colicinas, que inhiben otras cepas de E. coli potencialmente patógenas (Cabello, 2007).
Un tema importante deestudio de las bacterias como E. coli es su ADN, ya que esta es la biomolécula donde se guarda la información codificada, donde además los seres vivos sintetizan algunas de sus biomoléculas fundamentales para el funcionamiento como lo son las proteínas (Quesada, 2007).
El ADN es la unidad de herencia de todas las formas de vida en el planeta. En su secuencia de nucleótidos está la informaciónnecesaria para realizar la síntesis de proteínas de cada organismo necesarias para todos sus procesos, entre ellos división celular, en la cual se da origen a una nueva célula (Mayr and Río 1999). Para la extracción del ADN se realizan métodos físicos y químicos. Estos procesos requieren de mucho tiempo y dinero, pero casi todos siguen el mismo orden, ya que el ADN se encuentra al interior de lascélulas. Primero se homogenizan las células y posterior aislamiento de los núcleos de donde se aísla el ADN. Los núcleos se destruyen con un detergente (SDS) y a la vez impide la actividad de cualquier nucleasa. La solución se torna viscosa al liberarse el ADN. Luego se separa el ADN de sustancias contaminantes como proteínas con una solución de fenol/cloroformo. Y luego se centrifuga parasepararlas, pero deja ADN y ARN en solución. Para separarlas es necesario agregar etanol, el cual forma dos fases en las que se separa el ADN del ARN y es posible enrollar el ADN en una varilla de vidrio. (Karp, 2008)
En la práctica se espera extraer ADN de un cultivo de E. coli por medio del método de Marmur modificado, hacer un reconocimiento de la presencia de ADN con la reacción de difenilamina,cuantificar la cantidad de ADN extraído utilizando espectrofotometría y conocer el fundamento de los reactivos empleados.
Metodología
Para el desarrollo de la práctica se siguió el protocolo descrito en la guía “Obtención de ADN de Escherichia coli” del laboratorio de biología celular y bioquímica I, del departamento de biología, facultad de ciencias naturales y exactas, Universidad del...
Obtención de ADN de Escherichia coli
Resumen
En este laboratorio se realizo la extracción de ADN de Escherichia coli por el método de Marmur modificado. Para esto, se aplicó una lisis de células bacterianas usando una solución fresca de lisozima, que daña la membrana celular. Se continuo con la desproteinización y extracción del ADNagregando perclorato de sodio y cloroformo-alcohol isoamílico, el cual permite la extracción del ADN en una suspensión de dichas bacterias. Posteriormente se realizo una prueba cualitativa con difenilamina que indica la presencia de ADN dando un producto de color azul oscuro para la muestra patrón y azul claro para la muestra extraída, y dando negativo para el ARN y el blanco sin presentar cambiode color. Para la cuantificación del ADN extraído se realizó una curva de calibración (absorbancia Vs. concentración) por medio de espectrofotometría a una longitud de onda de 595 nm con el producto coloreado de la reacción de la difenilamina con ADN a diferentes concentraciones, donde se pudo calcular la concentración de ADN extraído de E. coli que fue de 0.25 mg/ml.
Palabras clavesEscherichia coli – Marmur – ADN – Difenilamina – Desprotenización
Introducción
Las bacterias constituyen un grupo heterogéneo de organismos desde el punto de vista morfológico. Las estructuras comunes en la mayoría de las bacterias son la pared celular, membrana plasmática y citoplasma en el cual se encuentra un ADN circular y numerosos ribosomas (Macarulla and Goñi, 1994). Escherichia coli esuna bacteria Gram-Negativa que se encuentra con mayor frecuencia en las heces de los mamíferos. Su nicho ecológico es el intestino grueso y delgado, hace parte de la flora nativa intestinal sin causar ningún daño, por el contrario, producen sustancias que son útiles al hospedero como las Colicinas, que inhiben otras cepas de E. coli potencialmente patógenas (Cabello, 2007).
Un tema importante deestudio de las bacterias como E. coli es su ADN, ya que esta es la biomolécula donde se guarda la información codificada, donde además los seres vivos sintetizan algunas de sus biomoléculas fundamentales para el funcionamiento como lo son las proteínas (Quesada, 2007).
El ADN es la unidad de herencia de todas las formas de vida en el planeta. En su secuencia de nucleótidos está la informaciónnecesaria para realizar la síntesis de proteínas de cada organismo necesarias para todos sus procesos, entre ellos división celular, en la cual se da origen a una nueva célula (Mayr and Río 1999). Para la extracción del ADN se realizan métodos físicos y químicos. Estos procesos requieren de mucho tiempo y dinero, pero casi todos siguen el mismo orden, ya que el ADN se encuentra al interior de lascélulas. Primero se homogenizan las células y posterior aislamiento de los núcleos de donde se aísla el ADN. Los núcleos se destruyen con un detergente (SDS) y a la vez impide la actividad de cualquier nucleasa. La solución se torna viscosa al liberarse el ADN. Luego se separa el ADN de sustancias contaminantes como proteínas con una solución de fenol/cloroformo. Y luego se centrifuga parasepararlas, pero deja ADN y ARN en solución. Para separarlas es necesario agregar etanol, el cual forma dos fases en las que se separa el ADN del ARN y es posible enrollar el ADN en una varilla de vidrio. (Karp, 2008)
En la práctica se espera extraer ADN de un cultivo de E. coli por medio del método de Marmur modificado, hacer un reconocimiento de la presencia de ADN con la reacción de difenilamina,cuantificar la cantidad de ADN extraído utilizando espectrofotometría y conocer el fundamento de los reactivos empleados.
Metodología
Para el desarrollo de la práctica se siguió el protocolo descrito en la guía “Obtención de ADN de Escherichia coli” del laboratorio de biología celular y bioquímica I, del departamento de biología, facultad de ciencias naturales y exactas, Universidad del...
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