aflatoxina procedimiento 2


1. OBJETIVO
Determinar el contenido de aflatoxinas totales presentes en los granos, utilizando lector de Elisa.

2. ALCANCE
Desde: El analista de ensayos físico-químicos
Hasta: Gerente de Calidad
Áreas que aplica: Laboratorio de Microbiología Alquimia S.A.

3. PRINCIPIO DEL METODO
La Prueba de Aflatoxinas totales es un análisis inmunoenzimatico directamente competitivo (ELISA). Lasaflatoxinas se extraen a partir de una muestra molida con una solución de metanol al 70%. El extracto de la muestra y el conjugado aflatoxina-enzima se mezclan y disponen en los pocillos recubiertos con anticuerpos. Las aflatoxinas de las muestras y los patrones de control compiten con las aflatoxinas conjugadas con enzimas por los sitios de unión disponibles de los anticuerpos. Tras el lavado, seagrega un sustrato para la enzima y se desarrolla un color azul. La intensidad del color es inversamente proporcional a la concentración de aflatoxina presentes en la muestra o los patrones. Se adiciona una solución stop, lo que produce un cambio de color tornando el azul en amarillo. Los pocillos se miden ópticamente, utilizando para ello un lector ELISA con un filtro de absorbancia de 450 nm y unfiltro de referencia de 630nm. La densidad óptica del as muestras se compara con las de DOs (densidades ópticas) de los patrones (estándares) y se determina un resultado interpretativo.

5.2. REFERENCIA
Método previsto por el proveedor

ROMER Labs: COKAQ1000/COKAQ1048



4. EQUIPOS Y MATERIALES
Para la extracción:

Trituradora eléctrica
Balanza analítica.
Licuadora
Vaso de precipitado de 250mlProbeta de 100 ml
Erlenmeyer de 100ml
Embudo
Timer(cronometro)
Papel de filtro cualitativo
Papel de aluminio
Para el ensayo:
Pipeta monocanal con puntas estériles de 1000 µL
Pipeta multicanal de 8 vías con puntas estériles de 300 µL
Timer (cronometro)
3 Cubetas para reactivos para pipeta multicanal de 8 vías
Piseta o botella de lavado
Toallas de papel absorbente
Gradillas para pocillos
Vaso deprecipitado de 250 ml
Stat Fax 4700 (lector ELISA)
Reactivos para extracción:
Agua destilada o desionizada.
Solución de metanol al C=70%
Reactivos para ensayo:
Agua destilada
Kit AgraQuant Aflatoxin, que incluye: pocillos con bordes verde, pocillos recubiertos con anticuerpo, conjugado, patrones (de 0, 4, 10,20 y 40 ppb), sustrato y solución stop.

5. PROCEDIMIENTO
El ensayo se realizará cada lunes oviernes o según sea la necesidad.
Materia prima: se analizarán los lotes según sea definido por el Gerente de Planta
Materia prima pre-recepción: se analizarán las muestras según sea definido por el Gerente de Operaciones y Eficacia
Producto terminado: todos los productos terminados serán analizados en su totalidad
En el caso de que el producto esté orientado para clientes de Japón, se tomaránmuestras por big bags y se analizarán por separado. Ejm: Si se tiene un lote con 20 big bags de 1000 Kg cada uno se tendrán 20 resultados para un mismo lote

5.1 . Preparación de la muestra/ extracción:
Se toma una muestra representativa del lote homogeneizado y se procede como sigue
1. Se extrae 100 g como mínimo de la muestra original y se tritura con la ayuda de un triturador
2. Disponer 20 g dela muestra molida dentro del vaso precipitado limpio presto a ser sellado en forma apropiada posteriormente.
3. Agregar 100ml de la solución de extracción 70/30(V/V) metanol/agua, sellar el vaso con papel aluminio
4. Licuar durante 3 minutos con la licuadora.
5. Trasladar a un vaso y dejar decantar la muestra por 5 minutos, y luego filtrar el sobrenadante a través de un filtro de papel cualitativo,colocado en un embudo, colectar el filtrado.
6. La muestra está lista para ser utilizada.

5.3. Marcha analítica:
Observación: todos los reactivos y componentes del kit deben estar a temperatura ambiente (18°C a 30° C) antes de usarlos.
1- Colocar un número apropiado de tiras de dilución con borde verde, en una fila de la gradilla para tiras de pocillos. Se requiere un pocillo de dilución por...