Aislacion y purificacion de albumina

PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CHILE FACULTAD DE QUÍMICA Departamento de bioquímica

CURSO LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

LACTOALBUMINA



Objetivo General: Aislar y purificar una proteína específica contenida en una muestra problema de Leche. Objetivos Específicos: 1.- Aislar y purificar la proteína Lactoalbúmina de la leche. 2.- Cuantificar la proteína Lactoalbúmina de la lecheFundamentos: 1.-Según el método de aislación de lactoalbúmina descrito por Kaplanas & Antanavichus (1975) 1 se procederá a la purificación de la proteína antes señalada haciendo alusión a las siguientes propiedades de las proteínas en nuestra solución problema. Según algunas propiedades específicas de las proteínas presentes en la muestra de leche, las cuales corresponden a : Caseína, Lactoalbúminas,lactoglobulinas, globulinas y suero de albúmina, es que en relación a sus propiedades químicas como la denaturación a temperaturas específicas, las formas de zwitter-ion de las moléculas que estabilizan sus cargas formales, propiedades polares frente a geles de filtración y sus afinidades en enlaces de alta energía frente a reactivos químicos que favorecen la separación de diversas proteínas en unaúnica muestra problema. 2.- La forma de cuantificar la proteína α-lactoalbumina será utilizando el método de Biuret, el cual se basa en el análisis de un complejo que toma una coloración muy puntual en condiciones especiales. Esto se produce cuando existen sustancias que poseen dos o más enlaces peptídicos que reaccionan con sulfato de cobre (alcalino), lo que produce la formación de un complejo decolor purpura- violeta. Este complejo es producido por la coordinación entre el átomo de nitrógeno del enlace peptídico, con el cobre (Cu+2). La intensidad del color depende de la concentración de la proteína. Para poder saber la concentración de la proteína a tratar, se debe realizar una “curva de calibración” usando soluciones estándares de la proteína, las cuales son tratadas con el reactivode biuret, midiendo su absorbancia a 540 nm. Entonces, la muestra de la proteína tratada se hace reaccionar con el reactivo de biuret para comparar con la curva de calibración, y luego determinar su concentración. 2

2

Procedimientos: a) Pasos para aislar lactoalbúmina de una muestra de leche: 1.- Eliminación de la Caseína: A la muestra de leche (referencia de 100 ml por experiencia) se leadiciona HCl concentrado hasta alcanzar un pH de 4.8, posteriormente la mezcla se somete a centrifugación por unos instantes. En un embudo gravimétrico adosado a un matraz, se ubica un papel de filtro para filtrar la mezcla del centrifugado, la fase líquida depositada en el matraz corresponderá a la leche libre de Caseína que queda en retención en el papel filtro. 2.- Eliminación de lactoalbúmina:Nuestra muestra líquida filtrada es sometida a temperatura oscilante en un rango de 40-60°C en un vaso de precipitado pequeño , recomendándose de no exceder esta temperatura por riesgo de denaturacion de lactoalbúmina, a esta temperatura antes señalada se formara una especie de “manto blanco” correspondiente a la “Nata” de la leche, la cual debe ser extraída de la muestra constantemente hasta queno se forme más “Nata” en nuestra muestra, esto significará la ausencia de lactoalbúmina de nuestra muestra. 3.-Eliminación de Globulinas: A nuestra muestra líquida resultante del paso anterior se le adiciona una solución de (NH4)2SO4 saturada al 50%, la cual es agregada a la muestra y esta sometida a centrifugación y posterior separación del sobrenadante del resto del centrifugado, este proceso serepetirá agregando (NH 4)2SO4 saturada al 50%, hasta que no haya más formación de precipitado, esto indicará la eliminación total de globulinas de la muestra. 4.-Separación de lactoglobulina: Pese a estar presente en nuestra muestra, no es necesaria su eliminación, debió a que se encuentra en una pequeña cantidad y no resulta interferente de nuestro resultado para lactoalbúmina, en el caso que...