Aislación Y Espectroscopia De Dna
Páginas: 20 (4892 palabras)
Publicado: 29 de noviembre de 2012
Laboratorio #: Aislación y Espectroscopia de DNA
Introducción:
El genoma bacteriano se organiza en un único cromosoma circular con un sólo origen de replicación. Las bacterias pueden contener información genética adicional en forma de plásmidos. Las bacterias pueden llegar a tener un gran número de copias de un mismo plásmido, facilitando enormemente su purificación. Muchas de lastécnicas realizadas para el estudio del material genético requieren la purificación de cantidades amplias de DNA. La aislación del material nuclear de las células es un proceso relativamente sencillo. La lisis de la pared celular da por resultado la liberación del material nuclear. Este material puede ser recolectado, pero puede presentar una serie de contaminantes, proteínas y RNA, que deben serremovidos por una serie de métodos para así obtener una fracción purificada de DNA.
La aislación de material genético es una técnica ampliamente utilizada y es base para la generación de múltiples aplicaciones biotecnológicas. Por otra parte la purificación de material genético estrcromosomico, plásmidos, es de vital importancia en los proceso de clonación y multiplicación de genes in vitro. Unproblema básico es el distinguir, relativamente, la cantidad menor de DNA plásmido contenida en la cantidad mayor de DNA cromosomal. El DNA plásmido es aislado comúnmente de células bacterianas, es por tal razón que la lisis celular es una etapa de vital importancia en el proceso. La rotura celular insuficiente brinda por resultado un rendimiento bajo en la obtención de DNA extrecromosomal, así tambiénsi ocurre una lisis exagerada. El método mas utilizado para la extracción de DNA de células esta basado en el procedimiento de lisis alcalina, el cual parte de la ventaja brindada por la alcalinidad del pH (entre 12.0 y 12.5) que posee el DNA lineal, pero no el DNA circular, el cual pasa a un estado de desnaturalización. Este proceso resulta inevitable para el rompimiento del genoma circular de E.Coli, generado un fragmento grande de DNA lineal. La mayoría de los métodos para purificar plásmidos requiere el uso de cultivos pequeños de la célula bacteriana obtenido un amplio rendimiento en la purificación del material.
Existen varios métodos para la recuperación de ácidos nucleicos DNA extracromosomal son una alternativa comercial que ofrece un método simple, rápido y económico para lapurificación de DNA de un cultivo de bacteria E. Coli recombinante. El kit emplea el procedimiento principal que elimina muchos de los pasos convencionales en la preparación de la aislación del material extracromosomal. La eliminación de estos pasos no interfieren en la recuperación de 2-6µg de copias de DNA (plásmidos) por medio de centrifugación, a partir de 400µl de cultivo de E. Coli, en 5minutos.
Utilizando un cultivo de E. Coli inoculado el día anterior, se procede a mezclar el mismo con una solución de lisis que ejerce su efecto rápidamente rompiendo las células y degradando el RNA, luego se le añade una solución de enlace que se mezcla con el lisado, esta solución se transfiere a una columna a base de silica, donde por centrifugación se captura el DNA. Las impurezas sonremovidas con lavados con etanol al 70% y finalmente el plásmido es eluido con agua o el amortiguador Tris.
El DNA (plásmido) es recuperado predominantemente de la forma superenrollada. Esto no es una evidencia visual de que el DNA o RNA gnómico, contaminante, está presente en la extracción por tanto se procede a realizar una electroforesis de agarosa que reafirme esta extracción. Luego de esto el DNAestá preparado para ser utilizado inmediatamente en aplicaciones como digestión enzimática, secuenciación, PCR, ligación y transfección.
Luego de la manipulación de los ácidos nucleicos, lo mas probable es que también se requiera su cuantificación exacta para garantizar resultados ópticos y reproducibles. Los ácidos nucleicos absorben eficientemente luz ultravioleta debido a la presencia de...
Introducción:
El genoma bacteriano se organiza en un único cromosoma circular con un sólo origen de replicación. Las bacterias pueden contener información genética adicional en forma de plásmidos. Las bacterias pueden llegar a tener un gran número de copias de un mismo plásmido, facilitando enormemente su purificación. Muchas de lastécnicas realizadas para el estudio del material genético requieren la purificación de cantidades amplias de DNA. La aislación del material nuclear de las células es un proceso relativamente sencillo. La lisis de la pared celular da por resultado la liberación del material nuclear. Este material puede ser recolectado, pero puede presentar una serie de contaminantes, proteínas y RNA, que deben serremovidos por una serie de métodos para así obtener una fracción purificada de DNA.
La aislación de material genético es una técnica ampliamente utilizada y es base para la generación de múltiples aplicaciones biotecnológicas. Por otra parte la purificación de material genético estrcromosomico, plásmidos, es de vital importancia en los proceso de clonación y multiplicación de genes in vitro. Unproblema básico es el distinguir, relativamente, la cantidad menor de DNA plásmido contenida en la cantidad mayor de DNA cromosomal. El DNA plásmido es aislado comúnmente de células bacterianas, es por tal razón que la lisis celular es una etapa de vital importancia en el proceso. La rotura celular insuficiente brinda por resultado un rendimiento bajo en la obtención de DNA extrecromosomal, así tambiénsi ocurre una lisis exagerada. El método mas utilizado para la extracción de DNA de células esta basado en el procedimiento de lisis alcalina, el cual parte de la ventaja brindada por la alcalinidad del pH (entre 12.0 y 12.5) que posee el DNA lineal, pero no el DNA circular, el cual pasa a un estado de desnaturalización. Este proceso resulta inevitable para el rompimiento del genoma circular de E.Coli, generado un fragmento grande de DNA lineal. La mayoría de los métodos para purificar plásmidos requiere el uso de cultivos pequeños de la célula bacteriana obtenido un amplio rendimiento en la purificación del material.
Existen varios métodos para la recuperación de ácidos nucleicos DNA extracromosomal son una alternativa comercial que ofrece un método simple, rápido y económico para lapurificación de DNA de un cultivo de bacteria E. Coli recombinante. El kit emplea el procedimiento principal que elimina muchos de los pasos convencionales en la preparación de la aislación del material extracromosomal. La eliminación de estos pasos no interfieren en la recuperación de 2-6µg de copias de DNA (plásmidos) por medio de centrifugación, a partir de 400µl de cultivo de E. Coli, en 5minutos.
Utilizando un cultivo de E. Coli inoculado el día anterior, se procede a mezclar el mismo con una solución de lisis que ejerce su efecto rápidamente rompiendo las células y degradando el RNA, luego se le añade una solución de enlace que se mezcla con el lisado, esta solución se transfiere a una columna a base de silica, donde por centrifugación se captura el DNA. Las impurezas sonremovidas con lavados con etanol al 70% y finalmente el plásmido es eluido con agua o el amortiguador Tris.
El DNA (plásmido) es recuperado predominantemente de la forma superenrollada. Esto no es una evidencia visual de que el DNA o RNA gnómico, contaminante, está presente en la extracción por tanto se procede a realizar una electroforesis de agarosa que reafirme esta extracción. Luego de esto el DNAestá preparado para ser utilizado inmediatamente en aplicaciones como digestión enzimática, secuenciación, PCR, ligación y transfección.
Luego de la manipulación de los ácidos nucleicos, lo mas probable es que también se requiera su cuantificación exacta para garantizar resultados ópticos y reproducibles. Los ácidos nucleicos absorben eficientemente luz ultravioleta debido a la presencia de...
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