Aislamiento de ADN plasmidico

Práctica No. 9 Aislamiento de DNA plasmídico por lisis alcalina

Resumen
Se realizó el aislamiento de DNA plasmídico de Escherichia Coli por medio de una lisis alcalina. A través del tratamiento de células con detergente para la desnaturalización del DNA, seguido de la precipitación de éste con isopropanol y acetato de sodio, se obtuvieron diversas muestras que se corrieron en unaelectroforesis horizontal en un gel de agarosa al 1% para ser observadas al transiluminador. Se observaron dos bandas un poco circulares en los primeros pozos ya que el DNA plasmídico presenta moléculas de plásmido de dos conformaciones.

Introducción
Los plásmidos o vectores son moléculas de ADN extracromosómico circular que se replican y transcriben independientemente del ADN cromosómico. Se encuentrannormalmente en bacterias y en algunas ocasiones en levaduras. Su tamaño puede ir desde 1 hasta 250 kb, y en número de copias puede haber desde 1 hasta 100, dependiendo del tipo de plásmido.

Los mismos poseen DNA de doble hebra, mayormente son circulares pero también se han encontrado plàsmidos lineales. La replicación de los plasmidos es independiente de la replicación del cromosoma delhuésped ya que los plasmidos poseen su propio origen de replicación. El número de copias de un plasmido en la célula es variable, todo depende del origen de replicación del que posea el mismo y su regulación.

Los plàsmidos no son esenciales para el desarrollo o supervivencia de la célula pero le proveen una ventaja competitiva a las células que los poseen, dado a que los plasmidos poseen genes quele confieren características selectivas a su huésped tales como resistencia a antibióticos, nuevas habilidades metabólicas como degradación de carbohidratos, factores de virulencia y producción de toxinas entre otros.

Los plásmidos poseen un interés singular en Ingeniería Genética por ser uno de los sistemas vectores más sencillos de usar. Un vector de clonación es un sistema que permiteintroducir en una célula hospedadora un fragmento de DNA que se pretende clonar; en esta célula hospedadora el vector se replica y expresa, en su caso.

La molécula que resulta de la unión de un DNA vector con el DNA de interés (denominado entonces "inserto") se denomina molécula de vector recombinante. Existen unos requerimientos básicos que un plásmido debe poseer para que sea un buen vector alaplicar su uso en la biología molecular. Debe poseer un origen de replicación, un gen para un marcador de selección (ya sea resistencia a algún antibiótico) y un lugar de clonaje múltiple (MCS). Existen diversos métodos para el aislamiento de plasmidos. Las técnicas de Minipreps o mini preparaciones de plasmidos, permiten la recuperación de plasmidos de DNA circular sobre el DNA cromosomal.Objetivo
Aprender los fundamentos para el aislamiento y el análisis de la molécula de ADN.

Hipótesis
Se observarán bandas circulares en el gel de agarosa al ser vistas por el transiluminador.

Materiales
Puntas para micropipeta
-Micropipetas
-Cámara de electroforesis horizontal
-Peines
-Fuente de poder
-Matraz Erlenmeyer 250 mL
-Guantes de látex
-Balanza analítica
-Microondas
-Papelparafilm
-Centrífuga
-Transiluminador

Sustancias
-Solución I: Buffer GET (glucosa 20mM, tris base 25mM, EDTA 10mM)
-Solución II: mezcla lítica (SDS 1%, NaOH 0.2N)
-Solución III: acetato de sodio 3M pH 4.8
-Agarosa 1.2% -Bromuro de etidio -Muestras de ADN
Metodología
De uncultivo se centrifugaron 10 ml por 10 minutos a 14000 rpm, se descartó el sobrenadante. Luego se le añadió 1 ml de buffer GET para resuspender y pasar a un tubo eppendorf de 1.5 ml (Fig.1), se centrifugo a 14000 rpm por 2 minutos, y se descartó el sobrenadante. Se le agregaron 100 micro litros de solución GET para re suspender, se incubo a 10 minutos a temperatura ambiente.


Fig.1 Muestras en...