Aislamiento De Arn

PRÁCTICA 5.- Aislamiento de ARN

PRÁCTICA 5.- Aislamiento de ARN

INTRODUCCION
Una célula típica contiene 10 veces más ARN que ADN. El azúcar presente en el ARN es la ribosa. Esto indica que en la posición 2' del anillo del azúcar hay un grupo hidroxilo (OH) libre. Por este motivo, el ARN es químicamente inestable, de forma que en una disolución acuosa se hidroliza fácilmente. En el ARN labase que se aparea con la A es U, a diferencia del ADN, en el cual la A se aparea con T.

Según las modernas teorías sobre el origen de la vida, parece bastante probable que el ARN fuese el primer biopolímero que apareció en la corteza terrestre durante el transcurso de la evolución.
Se distinguen varios tipos de RNA en función, sobre todo, de sus pesos moleculares:
* RNA MENSAJERO (RNAm):Del 1 al 3% en eucariontes. Se sintetiza sobre un molde de ADN por el proceso de transcripción por el cual se copia el ARN a partir del molde del ADN, pasa al citoplasma y sirve de pauta para la síntesis de proteínas (traducción).
* RNA RIBOSÓMICO (RNAr): 80% en eucariontes. El RNA ribosómico (RNAr) está presente en los ribosomas, orgánulos intracelulares implicados en la síntesis deproteínas. Su función es leer los RNAm y formar la proteína correspondiente.
* RNA de transferencia (RNAt): 15% en eucariontes. Son cadenas cortas de una estructura básica, que pueden unirse específicamente a determinados aminoácidos. (biología edu, 2008)
La extracción de ARN utilizando el reactivo Trizol se basa en la solubilidad diferencial de las moléculas (ácidos nucleicos y contaminantes) entredos fases no miscibles. El Trizol está compuesto por una mezcla de fenol (donde los ácidos nucleicos son insolubles) y tiocianato de guanidina (agente desnaturalizante de proteínas e inhibidor de proteasas) a pH 4,5. Así la integridad del ARN se mantiene durante la extracción.
Método de extracción de RNA (2010).

La adición de cloroformo, seguida de una centrifugación permite separar la faseacuosa superior, que contiene el ARN, de la fase orgánica (proteínas y ADN). El ARN se recupera mediante una precipitación con isopropanol. La extracción de RNA de alta calidad para reacciones enzimáticas es un requisito para estudios de respuestas moleculares durante el proceso de desarrollo en café. Los actuales métodos para el aislamiento de ARN implican procedimientos con gran número de pasos losque favorecen la degradación del RNA y requieren de al menos 1 g de material vegetal para la extracción.

Así mismo el procedimiento de lisis celular es determinante para lograr una alta calidad del ARN extraído en células de en cultivo de suspensión.
El trizol es un reactivo listo para utilizarse en el aislamiento de ARN de células y tejidos, es una solución mono-fásica de fenol eisocianato de guanidina que durante la homogenización o lisis de la muestra mantiene la integridad del RNA, al mismo tiempo que altera la estabilidad de las células y disuelve los componentes celulares. Ha demostrado estabilidad hasta por 12 meses a temperatura ambiente sin embargo se recomienda almacenarlo a temperatura de 2-8°c para un optimo rendimiento.

La adición de cloroformo seguida decentrifugación separa la muestra en dos fases, una de ellas acuosa y la otra orgánica, el RNA permanece exclusivamente en la fase acuosa y puede ser recuperado por precipitación con alcohol isopropílico, una vez removida la fase acuosa el ADN y las proteínas en la muestra pueden ser recuperadas por precipitaciones secuenciales de la misma. (Hernández, 2010)

Una típica célula de mamíferos contieneaproximadamente 10 -5 µg de RNA, 80-85% del cual es ribosomal. El remanente 15-20% consiste de RNAs de bajo peso molecular (RNAs de transferencia y pequeño nuclear). Estos RNAs abundantes han sido determinados en tamaño y secuencia, y pueden ser aislados por electroforesis, centrifugación a través de gradientes de densidad, o cromatografía de intercambio iónico. En contraste con el RNA...