Aislamiento De Distintos Tipos De Celulas En La Sangre

INTRODUCCIÓN
Durante las sesiones de prácticas que hemos realizado, se ha intentado integrar los conocimientos aprendidos en las clases de teoría y el uso del material de laboratorio para conocer verdaderamente el fundamento de los distintos ensayos inmunológicos que se realizan en un laboratorio de investigación oficial. En primer lugar, realizamos el aislamiento de los distintos tipos decélulas presentes en la sangre, es decir, aquellas de origen hematopoyético. Posteriormente, hemos identificado el fenotipo de estas células así como su identificación a través de los receptores específicos que se encuentran en la membrana de cada tipo celular.
El primer ensayo realizado consistía en la separación y aislamiento de las células presentes en la sangre, en concreto, aislamos neutrófilos,por una parte, y linfocitos, por otra. Para poder llevar a cabo la separación nos basamos en las diferencias físicas que presentan ambos tipos celulares, como es el caso de su morfología.
En el segundo ensayo, se llevó a cabo la identificación de las células de la sangre en base a otro criterio, en este caso, nos basamos en los receptores específicos que presenta cada célula en su membrana. Demanera, que mediante el uso de anticuerpos marcados, podemos identificar el tipo celular presente en una muestra, atendiendo a la especificidad de los receptores que presenten las células.
En el tercer ensayo, realizamos la técnica ELISA que consiste en un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas, en el cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo unido a una enzima capaz degenerar un producto detectable como cambio de color o algún otro tipo. Para reducir los costes de este ensayo, empleamos un anticuerpo primario que reconoce al antígeno, que es reconocido por un anticuerpo secundario, el cual se encuentra unido a la enzima.
La técnica ELISA presenta numerosas aplicaciones, entre las que se encuentra la detección en pacientes de enfermedades autoinmunes, así comoen pruebas de diagnóstico clínico, búsqueda de anticuerpos monoclonales, clasificación de anticuerpos en isótopos, detección viral, y una amplia gama de aplicaciones dentro de los laboratorios de investigación.
MATERIALES Y MÉTODOS
Aislamiento de Linfocitos.

Para llevar a cabo el aislamiento de los linfocitos de la sangre, nos basamos en la diferencia de densidades de las distintas células,empleando para ello un colchón de densidad de Ficoll-Paque.
Cogemos 1ml de la muestra de sangre en un tubo de ensayo, a este volumen se le añade 3ml de PBS y a continuación se le añade a la mezcla 3ml de Ficoll. Centrifugamos el tubo de ensayo con su contenido, para acelerar el proceso, a 400g durante 35 minutos. Con la centrifugación los linfocitos se mezclan con el Ficoll, obteniéndose una bandacon una tonalidad turbia, sobre la cual se dispone otra banda superior en la que se encuentran los glóbulos rojos y el plasma de la sangre.
A continuación, se retira esta banda superficial, quedando la banda de linfocitos. Esta banda se somete a dos lavados con PBS, en el primer lavado se añaden 2ml, mientras que en el segundo se añade 1ml. De esta manera obtenemos una pequeña muestra delinfocitos purificados, que hacemos resuspender por inmersión. Este es el momento de llevar a cabo el frotis, tomamos 7,5l, realizamos el frotis sobre el porta, y una vez que se haya secado, realizamos la tinción de la muestra, se realiza en tres pasos:
Se realizan 5 inmersiones en fijador de 5 segundos aproximadamente cada una.
Se realizan 8 inmersiones en eosina de 5 segundos aproximadamente cadauna. Parece que la eosina no tiene la eficiencia esperada, por lo que realizamos más inmersiones que con el resto de reactivos.
Se realizan 5 inmersiones en hematoxilina de 5 segundos cada una.
Por último, se sumerge la muestra en agua para eliminar lo sobrante que no se haya fijado a la muestra. El frotis ya está listo para ser observado.
Aislamiento de Neutrófilos.
Para llevar a cabo...