Aislamiento de linfocitos
Páginas: 3 (509 palabras)
Publicado: 10 de septiembre de 2014
Genómica y proteómica
Práctica 2: “Aislamiento de linfocitos y monocitos de sangre
periférica.”
Introducción
El primer paso de numerosos análisis es el aislamiento de la fracción "mononuclear",es decir, linfocitos y monocitos, de sangre periférica. El método de aislamiento más utilizado se fundamenta en las diferentes densidades que presentan cada uno de los tipos celulares de la sangre(Figura 1).
Para conseguir la separación, la muestra de sangre se deposita sobre un líquido de densidad 1.077 g/ml, denominado Lymphoprep o Histopaque, y se centrifuga para acelerar la separación. Demanera que se aglutinan los eritrocitos, al aumentar su velocidad de sedimentación, por otro lado, se forma un gradiente con la densidad adecuada para separar los linfocitos.
Reactivos
- PBS pH 7.2- Medio de separación de linfocitos Ficoll – Metrizoato sódico (ej. Histopaque ) - Muestras de sangre periférica (6 ml en tubos vacutainer con EDTA)
Procedimiento
1) Sangre anticoagulada (EDTA,citrato, heparina...) o sangre desfibrinada.
2) Pipetear cuidadosamente sobre 2/3 del volumen de Histopaque (p.ej. 6ml sangre: 4ml de Histopaque). Evitar que la sangre y el medio de separación semezclen.
3) Centrifugar a 400g x 20 min a T.A (apr. 20°C).
4) Recoger la fracción mononuclear en un tubo eppendorf de 1.5 ml 5) Centrifugar a 250g x 10 min a T.A.
6) Decantar o aspirar el sobrenadante7) Resuspender el pellet celular en medio de cultivo o en PBS, ó agregar 1 ml de trizol para extraer el ADN. Almacenar a -70qC, hasta su uso.
8) Separar 50 ul de las células mononucleares y hacer unextendido en un portaobjetos
9) Realizar un extendido con las muestras de sangre total.
10) Teñir con Wrigth. Observar al microscopio. Tratar de identificar la cromatina sexual
Responde lassiguientes preguntas:
1. ¿A qué se debe el color observado en los núcleos de las células mononucleares?
Porque en el núcleo se encuentra el material genético entonces para que se pueda visualizar se...
Práctica 2: “Aislamiento de linfocitos y monocitos de sangre
periférica.”
Introducción
El primer paso de numerosos análisis es el aislamiento de la fracción "mononuclear",es decir, linfocitos y monocitos, de sangre periférica. El método de aislamiento más utilizado se fundamenta en las diferentes densidades que presentan cada uno de los tipos celulares de la sangre(Figura 1).
Para conseguir la separación, la muestra de sangre se deposita sobre un líquido de densidad 1.077 g/ml, denominado Lymphoprep o Histopaque, y se centrifuga para acelerar la separación. Demanera que se aglutinan los eritrocitos, al aumentar su velocidad de sedimentación, por otro lado, se forma un gradiente con la densidad adecuada para separar los linfocitos.
Reactivos
- PBS pH 7.2- Medio de separación de linfocitos Ficoll – Metrizoato sódico (ej. Histopaque ) - Muestras de sangre periférica (6 ml en tubos vacutainer con EDTA)
Procedimiento
1) Sangre anticoagulada (EDTA,citrato, heparina...) o sangre desfibrinada.
2) Pipetear cuidadosamente sobre 2/3 del volumen de Histopaque (p.ej. 6ml sangre: 4ml de Histopaque). Evitar que la sangre y el medio de separación semezclen.
3) Centrifugar a 400g x 20 min a T.A (apr. 20°C).
4) Recoger la fracción mononuclear en un tubo eppendorf de 1.5 ml 5) Centrifugar a 250g x 10 min a T.A.
6) Decantar o aspirar el sobrenadante7) Resuspender el pellet celular en medio de cultivo o en PBS, ó agregar 1 ml de trizol para extraer el ADN. Almacenar a -70qC, hasta su uso.
8) Separar 50 ul de las células mononucleares y hacer unextendido en un portaobjetos
9) Realizar un extendido con las muestras de sangre total.
10) Teñir con Wrigth. Observar al microscopio. Tratar de identificar la cromatina sexual
Responde lassiguientes preguntas:
1. ¿A qué se debe el color observado en los núcleos de las células mononucleares?
Porque en el núcleo se encuentra el material genético entonces para que se pueda visualizar se...
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