aislamiento de proteinas

CURSO 06/07

4. Proteínas: funciones biológicas y estructura
primaria.
Tema

Enlace peptídico. Péptidos y proteínas. Diversidad de
funciones biológicas. Niveles de organización
estructural de las proteínas. Separación y
purificación de proteínas. Estructura primaria.
Información a partir de la secuencia de aminoácidos.
Proteínas homólogas. Métodos de análisis de proteínasBIOQUÍMICA-1º de Medicina
Dpto. Biología Molecular
Jesús Navas

LOS AMINOÁCIDOS SE PUEDEN UNIR POR ENLACES PEPTÍDICOS

Dos aminoácidos

Eliminación de una
molécula de agua

Enlace peptídico

... Formación del enlace
CO-NH
Extremo amino

Extremo carboxilo
Garret & Grisham , 1999

PEPTIDOS Y PROTEINAS
•
•
•
•

Péptido: hasta 50 aminoácidos.
Oligopéptido: péptido pequeño.Polipéptido: péptido grande.
Proteínas oligoméricas: formadas por
subunidades idénticas llamadas protómeros.
• Proteínas sencillas y conjugadas (grupo
prostético)

SECUENCIA DE LA INSULINA
DE VACA
La insulina tiene dos
cadenas unidas por dos
puentes disulfuro. La
cadena A tiene 21 aa y la
B tiene 30 aa.

Garret & Grisham , 1999

Clasificación de proteínas según su grupo prostético(Lehninger, 2000)

Niveles de organización de las proteínas

Estruct. primaria

Aminoácidos

Estruct. secundaria

Hélice alfa

Estruct. terciaria

Cadena polipeptídica

Estruct. cuaternaria

Subunidades ensambladas

(Lehninger, 2000)

Clasificación de proteínas según su grupo prostético

(Lehninger, 2000)

PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE PROTEÍNAS
1. Obtención del extractocrudo
2. Fraccionamiento del extracto crudo por precipitación con sulfato
amónico y diálisis
3. Cromatografía en columna:
•
•
•

Por su carga: cromatografía de intercambio iónico
Por su masa: cromatografía de filtración molecular
Por sus propiedades biológicas: cromatografía de afinidad

4. Electroforesis en gel:
•
•
•

Electroforesis en poliacrilamida-SDS
Enfoque isoeléctricoElectroforesis bidimensional

Diálisis

Cromatografía
de intercambio
iónico

(Lehninger, 2000)

Cromatografía
de exclusión
molecular

(Lehninger, 2000)

W

Cromatografía
de afinidad

(Lehninger, 2000)

Separación de proteínas por electroforesis
en geles de poliacrilamida-SDS

Patrones

Determinación de la masa molecular de una proteína por
electroforesis enpoliacrilamida-SDS

Sangre: células y proteínas plasmáticas
• La sangre es un sistema de transporte y
distribución de nutrientes.
• Está formada por una solución acuosa que
contiene moléculas de tamaño variable y diversos
tipos de elementos celulares.

Plasma y suero
• Los elementos formes de la sangre se encuentran
en una suspensión acuosa denominada plasma. Es
el sobrenadante obtenido alcentrifugar una
muestra de sangre tratada con anticoagulante.
• Suero: sobrenadante obtenido al centrifugar una
muestra de sangre después de haber dejado que
coagule. La mayoría de las determinaciones
químicas se hacen en suero.

Proteínas plasmáticas
• Sintetizadas en el hígado: albúmina.
• Producidas por las células plasmáticas de la
médula ósea: inmunoglobulinas.

- 50% de laproteína plasmática humana
- Concentración en sangre: 35-55 g/l
- Pm = 66 kDa, muy soluble en agua.
- A pH 7 es un polianión con 20 cargas negativas (fija muchos
ligandos)
- Posee hendiduras hidrófobas capaces de fijarse a ácidos grasos

PROTEINOGRAMA
•
•
•

Proteínas totales: 6-8 g/100ml
Albúmina: 3’5-5’5 g/100 ml
Globulinas: 2-3 g/100 ml
ELECTROFORESIS

Albúmina
Globulinas
α1
α2
βγ

45-55 % total
5-8 %
8-13 %
11-17 %
15-25 %

PATRONES DE ALTERACION DEL PROTEINOGRAMA

Separación de proteínas por electroenfoque

(Lehninger, 2000)

Electroforesis bidimensional de proteínas

(Lehninger, 2000)

La electroforesis bidimensional (isoelectroenfoque + electroforesis en
SDS) permite separar las 4.000-5.000 proteínas de una célula
Segunda

Primera...