Aislamiento De Una Macromolécula Celular. Purificación De Adn Plasmídico y Genómico De Células Bacterianas

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Bioquímica I Curso 2011 Trabajo Práctico Nº 1:
IMPORTANTE: NO OLVIDE LLEVAR AL LABORATORIO GUARDAPOLVO Y CALZADO CERRADO Objetivos del TP: Aislamiento de una macromolécula celular. Purificación de ADN plasmídico y genómico de células bacterianas Uno de los objetivos centrales de las ciencias bioquímicas es el conocimiento de la función de cada uno de los componentes celulares, en el marcode una visión integradora desde la que las respuestas y acciones de la célula puedan ser interpretadas en términos moleculares. En ese contexto, la posibilidad de contar con moléculas específicas aisladas del resto del material celular, es en general el paso con el que se inicia el conocimiento de nuevos componentes y de sus funciones. Obtener componentes celulares específicos tratando de quepreserven la misma estructura que en la célula (estructura nativa) ha sido, y es también hoy, una actividad central en los estudios bioquímicos experimentales. La complejidad estructural de la célula y la diversidad de moléculas que la componen hacen que la obtención de un componente específico con alto grado de pureza sea en muchos casos un desafío difícil. El éxito del trabajo dependerá de encontrarcondiciones de ruptura celular, de extracción, y de purificación que sean específicas para el componente de interés que desea obtenerse, dejando en el camino todo el resto celular remanente. Será por tanto imprescindible aprovechar las características de carga, solubilidad, tamaño, y propiedades fisicoquímicas en general de la molécula buscada para intentar aislarla del resto. Las estrategias yresultados de un proceso de purificación podrán así ser desde muy sencillas a muy complejas dependiendo del tipo de molécula a purificar, y de su semejanza química con otros componentes celulares. La complejidad será mayor si trata de aislar un componente nuevo cuya estructura (y a veces características químicas) no conoce en detalle. Veremos a lo largo del curso de bioquímica diferentesmetodologías para bordar este desafío, y el modo en que debe seguirse el avance de un proceso de purificación. En este trabajo práctico queremos introducirlo a Ud. al aislamiento, con aceptable grado de pureza, de distintas fracciones del DNA de una célula bacteriana. La idea es que Ud. se familiarice con métodos de ruptura celular y de abordaje a la extracción de un componente específico (ADN de plásmidos yADN genómico en este caso) a través de una marcha experimental. Esperamos que, con las explicaciones y ayudas de la guía de TPs Ud. piense paso a paso qué eventos ocurren a lo largo del proceso de purificación. Por qué se agrega cada reactivo, qué componentes quedan en el camino, y qué componentes son retenidos para el paso siguiente. Recuerde que el éxito de la purificación dependerá que Ud.maneje paso a paso dónde se encuentra su molécula de interés (y porqué), de modo que sea la mayoritaria al final de proceso. Extracción de ADN plasmídico: Existe una gran variedad de métodos para el aislamiento de ADN plasmídico. Estos métodos se diferencian entre otros en la pureza del producto final, en el tiempo necesario para llevarlos a cabo y en la posibilidad de aplicarlos en aislamientos apequeña o gran escala. Sin embargo todos estos métodos incluyen etapas comunes como

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ser el cultivo de las bacterias, cosecha y lisis de las bacterias y purificación del ADN plasmídico. La mayoría de los métodos explota, de una u otra forma, las diferencias existentes entre el ADN cromosómico y el ADN plasmídico: El procedimiento de desnaturalización alcalina constituye la base de variosprotocolos de extracción de ADN plasmídico. Para la extracción de ADN plasmídico se lisan las células por el agregado de un detergente (por ejemplo SDS) y NaOH. Las condiciones alcalinas (pH 12-12,5) desnaturalizan por completo las moléculas lineales de ADN, pero no las moléculas del plásmido las cuales sufren una desnaturalización parcial. El ADN plásmido que en relación al ADN cromosómico es más...