Aislamiento DNA plasmidico


Universidad Autónoma de Querétaro- Campus Aeropuerto.
Laboratorio de Microbiología.
Lic. En Microbiología Semestre 2012-2.

PRACTICA # 2

EJERCICIO I: AISLAMIENTO DE DNA PLASMÍDICO.EJERCICIO II: DIGESTIÓN DE PLÁSMIDO Y ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA.


INTRODUCCION: Proporcionada por el estudiante.

OBJETIVOS: Obtener DNA plasmídico de células bacterianas mediante el método delisis celular por lisis alcalina.

MATERIAL:
Tubos Eppendorf
Centrifugadora 14 000 rpm
Micropipetas: 1000µl, 200 µl, 20 µl y 2 µl
Cultivo bacteriano que contenga plásmido
Hielera.REACTIVOS:
Solución I
Solución II
Solución III
Isopropanol
Etanol al 70%
Agua ultra pura

METODOLOGÍA:
1. De un cultivo bacteriano previo Se agregan 100µl y 500µl (1ml 1/2ml) a un tubo Eppendorf2. Centrifugar durante 1 min ½ a 12 000 rpm.
3. Decantar procurando no tirar la pastilla.
*NOTA: A partir de este paso, será necesario mantener en hielo mientras no sea ocupado.
4. Añadir 200 µlde solución I (homogenizar)
5. Añadir 400 µl de solución II. *NOTA: golpetear suavemente con las puntas de los dedos, hasta que en la muestra se observe una baba al momento de abrirla.
6. Incubamosen hielo 10 min.
7. Centrifugar a 12 000 rpm durante 10 min
8. Recuperar sobrenadante. *NOTA: A partir de este paso será necesario usar material nuevo.
9. Precipitar con 600 µl de isopropanol(MEZCLAR) .
10. Mantener a -20°C durante 20 min a 2 días *NOTA: Sera necesario que en la muestra se forme una turbidez.
11. Centrifugar 10 min a 12 000 rpm.
12. Se agregan 300µl Etanol al 70% parahacer el lavado.
13. Centrifugar 5min a 12 000 rpm.
14. Decantamos y dejamos secar.
15. Agregamos 30 µl de Agua ultra pura.

EJERCICIO II DIGESTIÓN DE PLÁSMIDO.
OBJETIVOS: Aprender las diferentesTécnicas de digestión de DNA plásmidico mediante diferentes endonucleasas de restricción.

MATERIAL:
Tubos Eppendorf (nuevos)
Micropipetas: 20µl, 2 µl y 200µl.
REACTIVO:
DNA
Buffer...