Aislamiento, purificación y caracterización de un adn plasmidial recombinante

I. INTRODUCCIÓN

Si bien es sabido que toda célula procariota posee su información en la forma de DNA cromosomal, existen algunos organismos que poseen además elementos génicos extracromosomales a los que se le conoce como Plasmidios. Estos son DNAs de doble cadena circular, que poseen la capacidad de replicarse en forma autónoma, gracias a que contienen en su secuencia un origen dereplicación. La mayoría de estos plasmidios poseen genes que codifican para proteínas de resistencia a antibióticos y una región de múltiple clonamiento, o sea una zona que posee sitios de corte para diversas enzimas de restricción [1]. Las dos características anteriores nos permite usar a los plasmidios como vectores en la generación de DNA recombinante, que contiene segmentos unidos de DNA procedentes dedos o mas fuentes, estos segmentos son unidos por las enzimas de restricción. Para analizar un DNA recombinante es necesario obtener muchas copias, esto se puede lograr introduciendo este DNA recombinante en una célula huésped, ya sea por electroporacion o shock térmico, donde se debilita la pared bacteriana permitiendo que el plasmidio recombinante pueda traspasarla. Las células que incorporanel plasmidio son seleccionadas mediante el sometimiento de las colonias a condiciones especiales, como a ampicilina. En el siguiente informe se expondrán los resultados de la extracción y caracterización de una plasmidio recombinante, pET-15b [2], al que le fue insertado parte del cDNA de la fructosa 1,6 bifosfatasa de riñón de cerdo, se usaron los sitios de corte NdeI y BamHI. Este plasmidio essolo de clonamiento y expresión, ya que posee como marcador la ampicilina, expresa una cola de histidina que se encuentra dentro del sitio de múltiple clonamiento, un segundo gen marcador lacI, y posee 5708b de bases. Tanto su secuencia promotora, su sitio de inicio de la transcripción y su termino es reconocida por la RNA polimerasa del fago T7 y sus componentes (factores de transcripción).FIGURA I
Mapa fisico del vector de expresión pE-15b y sitios importantes vector
Vector pET-15b (Cat. No. 69661-3, Novagen) Los sitios de interés de este plasmidio se encuentran ubicados en el sitio de múltiple clonamiento, representado por una flecha negra. Allí se observan los sitios de corte de BamHI y NdeI en posición 319 y 331 respectivamente. Ademas se observan los sitios de restricciónpara EcoRI (5706) y HindIII (29).

II.- MATERIALES Y MÉTODOS

EXTRACCIÓN DEL DNA PLASMIDIAL: Utilizando el método de Lisis Alcalina [3], se trabajo con a partir de cepas BL-21 DE de E.Coli crecidas hasta fase estacionaria y el fragmento de ADN exógeno clonado entre los sitios BamHI y NdeI del vector pET-15b, que corresponde a parte del cDNA de la enzima Fructosa 1,6 bifosfatasa de riñón decerdo. El método y los pasos a seguir, se encuentran detallados en la guía de practico, sin embargo se hizo una pequeña modificación el primer paso, donde se hicieron 3 centrifugaciones de 1 minuto a máxima velocidad para poder obtener una cantidad de pellet considerable para trabajar. Este método de lisis se basa en la propiedad de 2 de sus componentes: NaOH que denatura el DNA y el SDS que rompe lamembrana bacteriana, para que se libere el material genético que se busca aislar. El proceso se ilustra a continuación:

FIGURA II
Diagrama de flujo de la purificación de un ADN plasmidial mediante Lisis Alcalina

Se describe cada etapa involucrada en la aislamiento y purificación del ADN plasmidial.

CUANTIFICACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA ESTIMATIVA DEL DNA PLASMIDIAL: Medianteabsorbciometría podemos estimar la concentración y el grado de purificación del DNA plasmidial. Una propiedad de los ácidos nucleicos como de los nucleótidos libres es la de poseer un máximo de absorción a 260nm y las proteínas a 280 nm. La relación A260/A280 es usada para determinar la pureza del aislado, si la razón presenta un valor entre a 1,8 a 2,0, se dice que el nivel de pureza es adecuado para los...