Aislamiento e identificación del adn

Universidad de Guanajuato
Facultad de Medicina
León, Guanajuato

Laboratorio de Biología Molecular: Práctica 1
Aislamiento e identificación del ADN
Módulo Biología molecular, celular y tisular

Aislamiento e identificación del ADN

( Introducción
El Ácido Desoxirribonucleíco (ADN) es un polímero de unidades nucleotídicas, con alto peso molecular constituida por tres sustanciasdistintas: ácido fosfórico, un monosacárido aldehídico del tipo pentosa (desoxirribosa), y una base nitrogenada cíclica que puede ser púrica (adenina o citosina) o pirimidínica (timina o guanina). La unión de las bases nitrogenadas con la desoxirribosa) forma un nucleósido; éste, uniéndose al ácido fosfórico, nos da un nucleótido; la unión de los nucleótidos entre sí en enlace diéster nos da elpolinucleótido, ácido desoxirribonucleico.

El ADN es la base de la herencia pues es común a todas las células del organismo. Esta característica aunada al alto peso molecular del polinucleótido, hace su aislamiento de las demás estructuras celulares un proceso más fácil con las técnicas constantemente modernizadas.

El procedimiento que seguimos en la práctica del laboratorio de Biología Molecular, fueel aislamiento de fragmentos de DNA a partir de células sanguíneas. Estas se rompen para separar el ADN del demás contenido celular mediante detergentes. Luego se precipitan las proteínas mediante sales y el sobrenadante se retira. Después, a este último se le agrega alcohol para que la pastilla de DNA se precipite. Para este aislamiento, se utilizó el Kit Wizard Genomic DNA Purification, queayuda a eliminar los editorcitos, lisis de los leucocitos rompiendo su núcleo para liberar el DNA. Ayuda a la precipitación de las proteínas, se extrae el sobrenadante para continuar con el proceso de asilamiento del DNA.

( Objetivo general
El alumno adquirirá el conocimiento práctico de los procedimientos para el aislamiento, purificación e identificación de DNA en células humanas.

( Objetivosparticulares
1. Realizar la extracción y purificación de DNA de una muestra de sangre.
2. Realizar la cuantificación del DNA por espectrofotometría.
3. Realizar la electroforesis del DNA para su identificación.

( Material y equipo
- Muestras de sangre (tubo con anticoagulante EDTA)
- Guantes
- Tubos eppendorf de 1.5ml
- Micropipetas
- Puntas de 1 y 0.25ml- Isopropanol
- Etanol al 70%
- Hidróxido de sodio 8mM
- Agarosa 1%
- TAE 1X
- Regulador de carga
- Bromuro de etidio
- Equipo de electroforesis
- Vortex
- Microcentrífuga
- Transiluminador
- Cámara

( Metodología
1. En un tubo de 1.5ml depositar 300μl de sangre, agregando 900μl de solución de lisis celular mezclando por pipeteo de 5– 6 veces.
2. Incubar 10min a T. A., mezclando manualmente por inversión ocasionalmente.
3. Centrifugar a 13,000 rpm durante 20s a T. A.
4. Descartar el sobrenadante con una micropipeta, cuidando no tomar del fondo la pastilla celular.
5. Agregar 300μl de solución de lisis nuclear y mezclar por pipeteo hasta homogeneizar y no ver restos celulares.
6. Agregar 100μl de soluciónde precipitación de proteínas y mezclar con vortex por 10s.
7. Centrifugar a 13,000 rpm durante 4 min a T. A.
8. Remover el sobrenadante y ponerlo en un tubo nuevo.
9. Agregar 300μl de isopropanol y mezclar manualmente muy bien por inversión hasta ver las hebras de DNA precipitado.
10. Centrifugar a 13,000 rpm durante 1 min a T. A.
11. Descartar el sobrenadante.
12. Agregar300μl de etanol al 70% e invertir manualmente el tubo 5 ocasiones.
13. Centrifugar a 13,000 rpm durante 1 min a T. A.
14. Aspirar o decantar el sobrenadante y secar el exceso de etanol con papel absorbente.
15. Dejar secar por completo el DNA al aire libre a T. A.
16. Agregar 50μl de solución de rehidratación y resuspender la pastilla de DNA con vortex por 15s.
17. Incubar durante...